針刺對PERK-CHOP通路及胰腺組織中內質網應激的影響

芮靖琳 商志浩 黎柳嬌 李牧月 顏春妮 李君 何水輝 范郁山 苗芙蕊

(1廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530000；2廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院)

糖尿病(DM)可視為中醫“消渴”病范疇，雖然近些年西藥的臨床效果較好，但其藥物的毒副作用及耐藥性等因素仍不容忽視。針灸作為祖國中醫的重要組成部分在糖尿病的防治中發揮了極其重要的作用，在《千金要方》《針灸甲乙經》中都記載了諸多關于針灸治療消渴的穴位處方〔1〕。已有研究表明，RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶-增強子結合蛋白同源蛋白(PERK-CHOP)通路是介導內質網應激(ERS)發生的重要通路之一，當通路被活化，下游的CHOP過表達時能夠引起β細胞內ERS的發生。本研究對探討針刺對PERK-CHOP通路及胰腺組織中ERS的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 將SPF級雄性SD大鼠(220±20)g 80只，由廣西中醫藥大學實驗動物中心提供，適應性喂養1 w，隨機選取20只作為對照組，用普通飼料喂養4 w。其余60只用高脂高糖飼料喂養4 w，加低劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射制備STZ-DM大鼠模型，隨機血糖(RBG)≥16.7 mmol/L為STZ-DM大鼠，再隨機分成3組，分別是模型組、針刺治療組和藥物組，每組20只。

1.2主要試劑 山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、檸檬酸鹽緩沖液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、STZ、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺、過硫酸銨、甲叉丙烯酰胺購自美國Sigma公司；CHOP、PERK購自Bioworld公司；電化學發光(ECL)超敏發光試劑盒、預染蛋白購自Marker Thermo公司；檸檬酸鉛、戊二醛購自上海騰準生物科技有限公司；放射免疫沉淀法(RIPA)細胞裂解液(強)購自碧云天生物技術研究所；Tris堿購自Solarbio公司；丙酮、鋨酸、乙酸鈾購自北京化學試劑公司。

1.3主要儀器 電子天平(德國賽多利斯TE2101-L)、超低溫冰箱(海爾DW-86L490)、電熱恒溫水浴鍋(金壇醫療HHS-8)、臺式高速冷凍離心機(Thermo FisherST16R)、超凈工作臺(安泰SE-CJ-IFD)、全波長多功能酶標儀(TECAN InfiniteM200 PRO)、凝膠成像分析儀(Carestream MM1000)、半自動輪轉切片機(LeicaRM2245)、組織包埋機(賽默飛世爾Histocentre3)、多用脫色搖床(其林貝爾KB-900)、凝膠成像系統(美國伯樂GelDoc XR+)、全自動組織脫水機(LeicaASP300S)等。

1.4造模方法 對剩余60只大鼠(即造模組)進行造模，喂養期間大鼠們自由飲水、攝食，飼料為配制的高脂高糖飼料，每日常規更換1次飼料、飲用水及墊料。喂養1個月后，連續2 d對其進行小劑量STZ(30 mg/kg)腹腔注射，每次操作前12 h嚴格禁食，不需禁水，操作后繼續高脂高糖飼料喂養1 w后，采集尾靜脈血用血糖儀檢測隨機血糖，其值≥16.7 mmol/L者即造模成功。

1.5干預方法 干預期間各組大鼠均為普通飼料喂養，自由飲水、攝食，每日常規更換兩次飼料、飲用水及墊料，定期清潔消毒鼠籠及實驗室。(1)針刺治療組：將大鼠固定，撥開局部叢毛，常規消毒操作穴位后三里、內庭、胰俞(穴位定位參考張露芬教授主編的《實驗針灸學》〔2〕)，選用順和牌0.18×13 mm一次性針灸針針刺，后三里、胰俞直刺3～5 mm，內庭向后方斜刺2 mm，均行小幅度捻轉手法1 min。每次僅選取同一側的后三里和胰俞穴接通G6805Ⅱ型電針治療儀，調至連續波，電流強度為2 mA，頻率為4 Hz，以大鼠無嘶叫為宜。雙側穴位輪流選取接電，治療15 min/次，1次/d，7 d/w。(2)藥物組：予二甲雙胍100 mg/kg粉末與加溫蒸餾水混合成20 mg/ml濃度的溶液，按大鼠體重所需要的等效藥量灌胃給藥〔3〕。1次/d，7 d/w。(3)模型組和對照組：與針刺治療組同法固定大鼠15 min，不作任何干預處理，1次/d，7 d/w。各組均干預4 w后斷尾采血測隨機血糖。禁食12 h后稱重，用10%水合氯醛腹腔麻醉后，置冰碟上快速取出胰體、胰尾，置液氮中保存。

1.6觀察指標檢測方法 采用RT-PCR和Western印跡檢測各組胰腺組織CHOP、PERK mRNA和蛋白表達，使用電鏡觀測胰腺組織內質網形態。

1.7統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗，方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1干預后各組胰腺組織CHOP、PERK mRNA及蛋白表達 干預4 w后，模型組CHOP、PERK mRNA及蛋白表達均顯著高于對照組；與模型組比較，針刺治療組、藥物組CHOP、PERK mRNA及蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 各組CHOP和PERK mRNA及蛋白 表達

圖1 各組CHOP和PERK蛋白表達

2.2模型組、針刺治療組電鏡下內質網形態學改變 模型組胰腺組織的腺泡細胞內酶原顆粒減少(紅色箭頭)；可見內質網極度擴張(黃色箭頭)；細胞核內染色質散在分布核膜上(藍色箭頭)；腺泡細胞內細胞器豐富，未見線粒體水腫腫脹。針刺組胰腺組織的腺泡細胞內酶原顆粒急劇減少(紅色箭頭)；可見內質網輕微擴張(黃色箭頭)；腺泡細胞內細胞器豐富，部分線粒體明顯腫脹(黑色箭頭)。見圖2。

圖2 電鏡下內質網形態

3 討 論

內質網具有促進合成機體主要蛋白質、部分固醇和脂類，對已合成的蛋白質進行加工折疊和修飾的功能，它的穩態平衡有著十分重要的意義〔4〕。當發生未折疊蛋白反應(UPR)、內質網的過度負荷反應(EOR)或由于缺乏膽固醇引起的固醇調節原件結合蛋白質通路調節的反應時，都可能刺激內質網誘發ERS，打破平衡穩態〔5〕。其中，PERK-CHOP通路是介導ERS發生的重要通路之一，當通路被活化，下游的轉錄因子CHOP等蛋白過表達時能夠引起胰島β細胞內ERS的發生，最終極有可能引起胰島β細胞凋亡，導致2型DM的發生〔6～10〕。本研究結果說明針刺能夠對PERK、CHOP產生影響并降低其表達，同時改善胰腺組織中的ERS。

DM屬于中醫“消渴”范疇，是以多飲、多尿、多食、形體消瘦，或尿濁、尿有甜味為主癥的病證。它的發生常與先天不足和后天飲食、情志、勞欲等因素有關。病變臟腑主要在肺、胃、腎。本實驗中造模大鼠DM的發生與飲食不節因素有較大關系，病變臟腑主要涉及胃，久之必定會影響到肺、腎。基本病機是陰虛燥熱。后三里(足三里)是足陽明胃經的下合穴，《靈樞·邪氣藏府病形》中提出“合治內府”的理論，故針刺足三里穴能夠增強脾胃功能、補脾益氣，王媛等〔11〕、張月等〔12〕針灸治療T2DM辨證針刺足三里等穴，結果顯示能夠有效改善糖、脂代謝情況，胰島素敏感性指數等。內庭是足陽明胃經的滎穴，《難經·六十八難》中將滎穴的主治特點概括為：“滎主身熱”，故針刺此穴能夠改善因胃火旺盛而導致的多食易饑等癥狀。胰俞，又稱為胃脘下俞、胃管下輸三穴等，屬經外奇穴，為治療DM的經驗穴，正如《備急千金要方·卷二十一》：“消渴咽喉干，灸胃管下輸三穴……穴在背第八椎下，橫三寸間寸灸之?！贝笫蟮囊扔嵛挥诘?胸椎棘突下旁開7 mm，研究表明〔13,14〕針刺胰俞可以有效調節胰腺的內分泌功能，達到治療胰腺炎、消化不良等疾病和DM的目的。三個穴位配伍已經被證實在治療DM方面有較好的實驗和臨床療效。

綜上，當胰腺組織中發生ERS時，PERK-CHOP通路也隨之激活并對胰島β細胞的凋亡產生影響。而針刺可以通過干預ERS的發生，抑制PERK-CHOP通路的活化，從而減少胰島β細胞的凋亡，保護胰腺組織。