木犀草素對蛛網膜下腔出血大鼠PI3K/Akt信號通路及皮層微循環的影響

王大永 裴劍 洪銘巖 徐翔 高云鶴 鄭宇 王凱杰 崔建忠

(唐山市工人醫院 1神經介入科，河北 唐山 063000；2神經外科)

蛛網膜下腔出血(SAH)指因顱內動脈瘤、腦血管畸形等因素引起腦血管破裂，血液流至蛛網膜下隙而導致腦血管痙攣、遲發性缺血性神經功能障礙、腦積水、腦水腫等一系列癥狀，其致死率和致殘率較高〔1～3〕。腦皮層血液微循環障礙及遲發性血管痙攣是SAH的主要生理過程，會導致腦缺血，甚至腦死亡〔4，5〕。研究發現磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路激活在SAH過程中發揮腦和神經保護作用〔6，7〕。木犀草素(Luteolin)為中藥木犀草莖葉中的黃酮類化合物，具有抗感染及保護心血管等多種生物學效應〔8～10〕，但Luteolin對SAH過程中PI3K/Akt通路的調控作用及對腦皮層血液微循環的影響作用未見報導，本文探討Luteolin對SAH大鼠PI3K/Akt信號通路及皮層微循環的影響。

1 材料及方法

1.1材料 健康SPF級雄性SD大鼠，6～7 w育齡，體重200～220 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供〔SCXK(粵)2018-0002〕。飼養環境：12 h黑暗與12 h光照交替，24～25℃溫度。動物倫理委員會批準同意本研究，批號為IACUC-01(2018060917)。實驗嚴格遵循3R原則。Luteolin(山東臨沂艾澤拉斯生物公司，規格：20 mg)；蘇木素-伊紅(HE)染液(上海聯邁生物工程公司)；血栓素(TX)A2酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(無錫市東林科技發展公司)；5-羥色胺酶ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；兔抗大鼠內皮型一氧化氮合酶(eNOS)抗體(北京索萊寶科技有限公司)；磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸化(p)-PI3K抗體(武漢菲恩科技公司)；Akt及p-Akt抗體(美國Abcam)；RFLSIⅢ激光散斑血流成像系統(深圳市瑞沃德生命科技公司)；51600腦立體定向儀(美國Stoelting公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠SAH模型建立及分組給藥 50只大鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉后，經尾動脈抽取動脈血0.3 ml備用，參照文獻〔11，12〕暴露枕骨，用腦立體定向儀將0.3 ml自體動脈血注入枕大池，48 h后再次注入0.3 ml自體動脈血建立SAH大鼠模型，以二次注入前有少量血液在穿刺部位滲出為造模成功(共50只)；另取10只大鼠同法注入0.3 ml生理鹽水于枕大池作為Sham組。將建模成功的大鼠分為SAH組、Luteolin〔13〕低(5 mg/kg)、中(25 mg/kg)、高(50 mg/kg)劑量組及尼莫地平〔14〕組(0.1 mg/kg)，每組10只；各組均于造模成功后第2天開始腹腔注射給藥7 d，2次/d，Sham組與SAH組腹腔注射10 ml/kg生理鹽水。

1.2.2神經功能評分 末次給藥12 h后參照文獻〔12〕按Garcia評分法進行神經行為學評分，具體操作如下：1～2分，刺激大鼠身體兩側無反應，提尾懸空后肢時前肢無任何反應；3～4分，刺激大鼠身體兩側反應遲鈍，提尾懸空后肢時前肢輕微伸展，但伸展不對稱；5～6分，刺激大鼠身體兩側有轉頭反應，提尾懸空后肢時前肢都伸出對稱，總分以6分計，每組大鼠分別評分取平均值。

1.2.3激光散斑血流成像系統記錄腦皮層微循環情況及檢測皮層微動脈血管管徑及腦血流量(rCBF) 參照文獻〔15〕做透明顱窗進行散斑成像操作，具體方法如下：用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，暴露顱骨，用牙科鉆將頂骨約為3 mm×3 mm的區域磨薄至均勻透明狀，激光散斑成像儀按一定角度散發的光斑照射于顱窗表面，記錄600 s后，用散斑軟件計算同一部位皮層微動脈血管管徑及局部rCBF。

1.2.4各組腦組織HE染色病理學檢測 每組隨機取5只，參照文獻〔12〕用活體灌注生理鹽水和4%多聚甲醛法取腦組織，截取大腦視交叉平面至橫裂腦組織，制作石蠟切片，脫蠟、水化后行HE染色，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5ELISA檢測腦組織TXA2和5-羥色胺水平 每組取剩下的5只大鼠，斷頭取腦，取新鮮基底動脈處腦組織0.5 g，用組織勻漿液充分勻漿后，取均漿液，用ELISA試劑盒測TXA2和5-羥色胺水平。

1.2.6Western印跡檢測 p-PI3K/PI3K、p-Ak/Akt及eNOS蛋白表達 取組織勻漿液，提取胞質蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度，200 μg蛋白行電泳、轉膜操作，滴加一抗體(PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、eNOS，1∶1 000稀釋倍數)及內參(β-actin，1∶2 000)抗體4℃孵育24 h，加入1∶1 000的羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)二抗溶液37℃孵育125 min，增強化學發光法顯色，Image-J軟件分析條帶灰度值。

1.3統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1大鼠神經功能評分 SAH組大鼠神經功能評分〔(1.05±0.12)分〕顯著低于Sham組〔(5.99±0.11)分，P<0.05〕；Luteolin低、中、高劑量組大鼠神經功能評分〔(2.88±0.10)分、(3.52±0.11)分、(4.65±0.09)分〕依次顯著高于SAH組(P<0.05)，且呈劑量依賴性，Luteolin高劑量組與尼莫地平組神經功能評分〔(4.69±0.12)分〕差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2激光散斑成像染色組織病理損傷程度觀察 散斑成像記錄圖像顯示，Sham組腦皮層血液流動豐富，紅色血管清晰可見；SAH組皮層血管不清晰，血液流動較慢，且散斑軟件檢測微動脈血管管徑及rCBF較Sham組顯著降低(P<0.05)；Luteolin低、中、高劑量組可見少量清晰血管及血液流動，散斑軟件顯示微動脈血管管徑及rCBF較SAH組依次升高且呈劑量依賴性(P<0.05)，Luteolin高劑量組與尼莫地平組差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1，表1。

表1 各組微動脈血管管徑、rCBF、TXA2、5-羧色胺、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及eNOS蛋白水平比較

2.3HE染色組織病理損傷程度觀察 Sham組海馬區神經元排列整齊，結構清晰正常；SAH組海馬區可見大量神經元細胞水腫、變性、輪廓模糊，神經元細胞出現核溶解、固縮、碎裂甚至核消失；Luteolin低、中、高劑量組及尼莫地平組神經元細胞變性、壞死現象明顯改善，見圖2。

2.4Luteolin對微循環介導因子TXA2和5-羥色胺含量影響 SAH組TXA2和5-羥色胺含量較Sham組顯著升高(P<0.05)；Luteolin低、中、高劑量組TXA2和5-羥色胺含量較SAH組依次降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)，Luteolin高劑量組與尼莫地平組差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

圖2 各組海馬組織(HE染色，×400)

2.5Luteolin對大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及eNOS蛋白相對表達水平影響 SAH組腦組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及eNOS蛋白相對表達較Sham組顯著降低(P<0.05)；Luteolin低、中、高劑量組及尼莫地平組腦組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及eNOS蛋白表達較SAH組依次升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)，Luteolin高劑量組與尼莫地平組差異無統計學意義(P>0.05)，見表1、圖3。

1～6：Sham組，SAH組，Luteolin低劑量組,Luteolin中劑量組,Luteolin高劑量組，尼莫地平組圖3 Western印跡檢測p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及 eNOS蛋白表達

3 討 論

SAH發病率、致死率、致殘率逐年上升，嚴重威脅患者生命，大腦皮層血液微循環障礙和血管痙攣是導致患者腦死亡的主要原因〔4，5〕。目前臨床尚無治療SAH血液微循環障礙和血管痙攣安全有效的藥物，尼莫地平可改善SAH血液微循環障礙和血管痙攣，但價格昂貴、副作用較大，臨床應用受到很大限制〔16〕。

中藥天然提取物Luteolin對心血管疾病有保護作用，且安全性、有效性較高〔10〕，因此本研究推測Luteolin可能對SAH也有一定的治療作用，并采用經典的枕大池二次注血方法構建SAH模型〔17〕對此進行探究，研究結果表明Luteolin可增加腦皮層血流量、改善微循環障礙，減少腦神經元變性和死亡，改善SAH大鼠腦損傷。

eNOS可催化L-精氨酸肟末端的氮原子和氧分子產生一氧化氮(NO)，而NO可抑制血管內皮素釋放，使血管內皮舒張，緩解血管痙攣〔18〕。而增加催化活性的eNOS的表達，已成為預防和控制腦血管痙攣的主要途徑之一〔12〕。PI3K可激活Akt，活化的Akt可使鈣調節蛋白(CaM)結合的eNOS Thr49 殘基去磷酸化，并激活eNOS，從而改善血管內皮舒張，并改善微循環〔19〕。文獻研究發現PI3K/Akt信號通路和eNOS蛋白可介導腦組織血管內皮舒張、改善微循環，并參與SAH患者腦保護及神經保護作用。趙雅寧等〔20〕發現內皮素受體拮抗劑通過上調PI3K、Akt基因表達，保護SAH大鼠早后期腦損傷；金珂等〔21〕發現丙酮酸乙酯可通過上調p-PI3K、p-Akt表達，緩解SAH大鼠腦血管痙攣；Xie等〔22〕發現Exendin-4可通過激活GLP-1R/PI3K/Akt通路表達，抑制SHA后早期神經元凋亡、改善腦損傷。本研究結果提示Luteolin可能通過激活PI3K/Akt通路，增加eNOS含量，進而改善血管痙攣，改善SAH大鼠腦損傷。

綜上，Luteolin可能通過激活PI3K/Akt通路，改善微循環障礙和血管痙攣，減少腦神經元變性和死亡，改善SAH大鼠腦損傷。為臨床治療SAH提供一定的參考。但本研究未設置通路抑制劑進行研究，有待后續繼續研究。