穿山龍總皂苷經Nrf2/ARE通路抑制慢性腎臟病大鼠血管鈣化的作用

馬娟 郭銀雪 謝恂 張晶晶 黃寧川 (貴州中醫藥大學第一附屬醫院腎內科，貴州 貴陽 550000)

Inhibition effect of total saponin from rhizoma dioscorea nipponica on vascular calcification in rats with chronic kidney disease via Nrf2/ARE pathway

MA Juan, GUO Yin-Xue, XIE Xun,etal.

Department of Nephrology, the First Affiliated Hospital of Guizhou University of traditional Chinese medicine, Guiyang 550000, Guizhou,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the inhibition effect of total saponin from rhizoma dioscorea nipponica (TSRDN) on vascular calcification in rats with chronic kidney disease via nuclear factor erythroid E2-related factor(Nrf2)/antioxidant response element (ARE) pathway.Methods50 SPF grade adult male SD rats were randomly divided into control group, model group, TSRDN low dose group, TSRDN high dose group and calcitriol group, 10 rats in each group. The control group was fed with ordinary feed, and the remaining groups were fed with adenine (250 mg/kg, once/day) by gavage and fed with 1.8% high phosphorus feed for 4 weeks. At weeks 5～8, adenine was changed to gavage every other day. At the same time, TSRDN (80 mg/kg, 160 mg/kg) was administered orally to TSRDN low dose group and TSRDN high dose group by gavage. In the calcitriol group, calcitriol (0.045 μg/kg) was given by gavage, gavage volume 3 ml, the control group and the model group were orally administered with an equal volume of normal saline,once a day, continuous administration for 8 weeks. Blood samples were taken from the femoral artery, and the levels of calcium (Ca), phosphorus (P), serum creatinine (Scr), and urea nitrogen (BUN) were measured with an automatic biochemical analyzer, and then kidneys and aortic tissue were taken for hematoxylin-eosin (HE) staining to observe histological changes, and real-time qRT-PCR was used to detect Nrf2, heme oxygenase(HO)-1, NADPH quinineoxidoreductase(NQO)-1, γ-glutamylcysteine synthetase(γ-GCS), runt-related transcription factor(RUNX)2 and bone morphogenic protein(BMP)2 mRNA levels in the aorta.ResultsThe renal and aortic vascular structures of the control group rats were normal; the renal and aortic structures of the model group rats were severely damaged, and a large amount of crystalline adenine metabolites were deposited, and a continuous linear linear obvious calcified nodule was seen at the arterial media. Compared with the model group, the kidney lesions of rats in each TSRDN dose group and calcitriol group were significantly reduced, and adenine crystals were reduced, vascular structure damage reduced, and calcified nodules were reduced, which in the TSRDN high-dose group and calcitriol group were more obvious. Compared with the control group, the levels of Ca, Nrf2, HO-1, NQO-1, and γ-GCS mRNA in the model group, each TSRDN dose group and the calcitriol group were significantly decreased, and the levels of P, Scr, BUN, RUNX2 and BMP2 mRNA obviously increased(P<0.05). Compared with the model group, the levels of Ca, Nrf2, HO-1, NQO-1, and γ-GCS mRNA in rats in each TSRDN dose group and calcitriol group were significantly increased, and the levels of P, Scr, BUN, RUNX2 and BMP2 mRNA significantly decreased, and it was dose-dependent(P<0.05). The effect of TSRDN high dose group and calcitriol group was similar (P>0.05).ConclusionsTSRDN could improve renal function, calcium and phosphorus metabolism and inhibit vascular calcification in CKD rats. The mechanism might be related to the activation of Nrf2/ARE pathway by TSRDN.

【Keywords】 Total saponin from rhizoma dioscorea nipponica; Nrf2/ARE pathway; Chronic kidney disease; Vascular calcification

慢性腎臟病(CKD)是一個日益嚴重的公共衛生問題，其潛在結果是終末期腎病(ESRD)〔1〕。血管鈣化(VC)是磷酸鹽在血管組織中沉積的病理過程，常被認為是與ESRD相關的心血管疾病的主要危險因素〔2〕。CKD或ESRD患者的高心血管發病率和死亡率與VC的表現有關，而VC被懷疑與高磷血癥有關，高水平的磷酸鹽直接影響血管平滑肌細胞(VSMCs)并誘導鈣化〔3〕。因此，尋找VC的潛在分子靶點可能有助于CKD的治療。核因子E2相關因子(Nrf)2/抗氧化反應元件(ARE)通路是氧化應激和炎癥反應的主要傳感器和調節因子，與CKD的進展以及抗氧化和解毒有關〔4〕。Nrf2被發現是氧化應激介導的疾病的主要調節因子，當與ARE結合時，有助于調節細胞抗氧化和抗炎防御相關基因的表達〔5〕。研究表明，VC中Nrf2濃度較低，通過激活VSMCs中的Nrf2可以減弱VC〔6〕。穿山龍是薯蕷科多年生藤本植物穿山龍薯蕷根莖，對類風濕關節炎和過敏性皮炎等具有治療作用〔7〕。穿山龍總皂苷(TSRDN)為穿山龍提取物，具有良好的抗炎和免疫抑制作用，但TSRDN對VC的研究較少〔8〕。因此，本研究建立CKD大鼠模型，研究穿TSRDN通過調節Nrf2/ARE通路是否能減弱VC，探討TSRDN治療CKD血管鈣化的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級成年雄性SD大鼠購自上海交通大學實驗動物中心，12～14周齡，體重280～320 g，動物生產許可證號：SCXK(滬)2018-0004，動物使用許可證號：SYXK(滬)2018-0019，動物質量合格證號：20190547，所有大鼠在貴州中醫藥大學第一附屬醫院動物房中飼養，飼養溫度25℃左右，濕度60%左右。

1.2主要試劑與儀器 TSRDN(原料藥，純度99%，杭州達文生物有限公司，批號J-0670158)；骨化三醇(劑型：膠囊劑，規格0.25 μg，上海羅氏制藥有限公司，批號20190519)；腺嘌呤(純度99%，上海源聚生物科技有限公司，批號071226)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司，批號DP421)；qScript cDNA SuperMix試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(大連TaKaRa公司，批號RR047A、TK08045)：ASP300S型組織脫水機、EG1150型包埋機、Leica RM2255型全自動輪轉切片機等病理配套設備(德國Leica公司)；AU5800型全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)；DM2700P型顯微鏡(德國徠卡公司)；NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)；CFX-96型實時定量PCR儀(美國BD公司)。

1.3分組造模〔9〕及給藥 選50只大鼠適應性喂養1 w后進行實驗。將大鼠隨機分為對照組、模型組、TSRDN低劑量組、TSRDN高劑量組和骨化三醇組，每組10只。對照組用普通飼料喂養，其余各組用腺嘌呤(250 mg/kg，1次/d)灌胃和含1.8%高磷飼料喂養，連續4 w。第5～8周腺嘌呤改為隔日灌胃〔9〕，同時TSRDN低劑量組和TSRDN高劑量組分別灌胃給予TSRDN(80 mg/kg、160 mg/kg)〔10〕，骨化三醇組灌胃給予骨化三醇(0.045 μg/kg)〔11〕，灌胃體積3 ml，對照組和模型組灌胃給予等體積(3 ml)生理鹽水，每天給藥1次，連續給藥8 w后進行相關檢測。

1.4血清學指標的檢測 麻醉大鼠進行股動脈取血，分離血清，用全自動生化分析儀檢測鈣(Ca)、磷(P)、血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平。

1.5大鼠腎臟和主動脈組織形態學檢查 大鼠采血后，迅速摘取右側腎臟，去除包膜及腎周脂肪，同時分離剝離胸主動脈，進行甲醛固定，經脫水、包埋、切片(1 μm)，進行蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡觀察組織學變化。

1.6主動脈中Nrf2、血紅素加氧酶(HO)-1、磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶(NQO)-1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)、核心結合蛋白因子(RUNX)2和骨形態發生蛋白(BMP)2 mRNA水平測定 每組用5只大鼠取胸主動脈制成勻漿，使用TRizol試劑提取總RNA，通過NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀的260/280 nm和260/230 nm的吸光度值評估RNA水平和純度。使用qScript cDNA SuperMix試劑盒進行逆轉錄，實時qRT-PCR分析在CFX-96型實時定量PCR儀上進行。Nrf2、HO-1、NQO-1、γ-GCS、RUNX2和BMP2和β-actin引物由大連TaKaRa公司合成。引物序列：Nrf2上游引物為5′-CACATTCCCAAACAAGATGC-3′，下游引物為5′-TCTTTTCCAGCGAGGAGAT-3′；HO-1上游引物為5′-CGTGCTCGAATGAACACTCT-3′，下游引物為5′-GGAAGCTGAGAGTGAGGACC-3′；NQO-1上游引物為5′-CATCATTCAACTACGCCATG-3′，下游引物為5′-GTCCTTCAGCTCACCTGTGA-3′；γ-GCS上游引物為5′-TTACCGAGGCTACGTGTCAG-3′，下游引物為5′-CAAAAAGGGTGAGTGGGTCT-3′；RUNX2上游引物為5′-GCCGAGATCTCACCGACTAC-3′，下游引物為5′-GTCCAGAGCGACATAGCACA-3′；BMP2上游引物為5′-TCAAGCCAAACACAAACAGC-3′，下游引物為5′-ACATTCCCCATGGCAGTAAA-3′；β-actin上游引物為5′-GTTGGTTGGAGCAAACATCC-3′，下游引物為：5′-AAGCAATGCTGTCACCTYCC-3′。根據熒光定量PCR試劑盒說明，制備20 μl反應體系進行擴增，反應條件為95℃預變性1 min，95℃變性30 s，60℃退火5 s，共38個循環，72℃延伸5 s。采集熒光，以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt法計算Nrf2、HO-1、NQO-1、γ-GCS、RUNX2和BMP2 mRNA的表達量。

1.7統計學分析 采用SPSS23.0進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1TSRDN對大鼠腎臟組織形態學的影響 對照組大鼠腎臟小球結構正常清晰，腎小管上皮細胞排列整齊，腎間質未見成纖維細胞及炎細胞；模型組大鼠腎間質增生，腎小管破壞管腔擴大，伴炎性細胞間質浸潤，見大量黑色腺嘌呤代謝物結晶沉積；與模型組比較，各TSRDN劑量組和骨化三醇組大鼠腎小球，腎小管和間質病變明顯減輕，腺嘌呤結晶減少，TSRDN高劑量組和骨化三醇組較為明顯。見圖1。

2.2TSRDN對大鼠主動脈鈣化的影響 對照組大鼠主動脈血管結構正常；模型組大鼠血管結構破壞嚴重，在動脈中膜處見連續性線性分布的明顯鈣化結節；與模型組比較，各TSRDN劑量組和骨化三醇組大鼠結構破壞減輕，鈣化結節減少，TSRDN高劑量組和骨化三醇組較為明顯。見圖2。

圖1 TSRDN對大鼠腎組織形態學的影響(HE染色，×100，箭頭所指處為腺嘌呤結晶)

2.3TSRDN對大鼠血清中Ca、P、Scr和BUN水平的影響 與對照組比較，模型組、各TSRDN劑量組和骨化三醇組大鼠血清中Ca水平降低，P、Scr和BUN水平升高(P<0.05)；與模型組相比，各TSRDN劑量組和骨化三醇組大鼠血清中Ca水平升高，P、Scr和BUN水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)；TSRDN高劑量組和骨化三醇組作用相似，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 TSRDN對大鼠血清中Ca、P、Scr和BUN水平的影響

2.4TSRDN對大鼠主動脈中Nrf2、HO-1、NQO-1和γ-GCS mRNA水平的影響 與對照組比較，模型組、各TSRDN劑量組和骨化三醇組大鼠主動脈中Nrf2、HO-1、NQO-1和γ-GCS mRNA水平降低(P<0.05)；與模型組相比，各TSRDN劑量組和骨化三醇組大鼠主動脈中Nrf2、HO-1、NQO-1和γ-GCS mRNA水平升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)；TSRDN高劑量組和骨化三醇組作用相似，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.5TSRDN對大鼠主動脈中RUNX2和BMP2 mRNA水平的影響 與對照組比較，模型組、各TSRDN劑量組和骨化三醇組大鼠主動脈中RUNX2和BMP2 mRNA水平增高(P<0.05)；與模型組相比，各TSRDN劑量組和骨化三醇組大鼠主動脈中RUNX2和BMP2 mRNA水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)；TSRDN高劑量組和骨化三醇組作用相似，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 TSRDN對大鼠主動脈中Nrf2、HO-1、NQO-1、γ-GCS、RUNX2和BMP2 mRNA水平的影響

3 討 論

CKD已成為與高發病率相關的全球主要健康問題，高磷酸鹽血癥被認為是CKD發病率和死亡率的預后因素〔12〕。在本研究中，用腺嘌呤加高磷誘導CKD的大鼠顯示出典型的血管鈣化及BUN和Scr水平的升高，Ca和P的異常水平，表明成功建立了高磷誘導的VC模型。高磷酸鹽是動脈內側鈣化的關鍵因素。相關研究表明，血清磷酸鹽水平升高在ESRD患者廣泛的鈣化動脈壁和軟組織中起重要作用〔13〕。血管鈣化可發生在內膜，中膜或兩者中，鈣化多見于較大動脈的大動脈粥樣硬化斑塊中。本研究在CKD大鼠中發現了血管內側鈣化，與其他報道〔14〕一致。本研究使用TSRDN治療可顯著改善腎功能和降低VC，并減弱成骨標記RUNX2 mRNA的表達，其效果與骨化三醇相當。臨床上常采用維生素D制劑(骨化三醇)和鈣補充劑來調控CKD患者的鈣磷平衡，然而對晚期CKD患者療效較差〔15〕。

研究表明，激活Nrf2/ARE信號通路可能是一種有前途的預防癌癥進展的方法，同時Nrf2/ARE信號通路的激活可能通過促進VSMCs中的自噬來緩解高磷條件下的VC〔16〕。一項類似的研究表明，Nrf2抑制可以通過富馬酸二甲酯促進VC，從而在過表達的Nrf2培養物中鈣沉積被下調〔17〕。Nrf2/ARE通路控制著抗氧化劑和異源生物的抗氧化劑基因(如HO-1，γ-GCS，NQO-1和其他解毒酶基因)的表達，通過激活Nrf2/ARE調節基因可以抑制炎癥反應，而這些基因的表達降低會導致自身免疫性疾病并增加對氧化損傷的炎癥反應〔18〕。Nrf2活化藥物可減輕炎癥和氧化應激，誘導抗氧化劑基因的表達。二十二碳六烯酸(DHA)可以促進抗氧化酶的活化并改善Nrf2蛋白表達，從而促進自噬，而HO-1是Nrf2靶基因之一，可促進自噬并消除受損的線粒體，從而抑制脂多糖處理的大鼠肝臟中的氧化應激〔19〕。在靶向Nrf2的基因中，γ-GCS是合成谷胱甘肽(GSH)的重要調節劑，谷胱甘肽是最豐富的小分子抗氧化劑，可清除活性氧(ROS)并中和親電試劑。γ-GCS的增加可以增強GSH的合成，從而提高組織和細胞的抗氧化能力〔20〕。此外，NQO-1在防止親電試劑和反應性毒性方面的作用氧中間體〔21〕。本研究中發現TSRDN可以上調Nrf2、HO-1、NQO-1和γ-GCS mRNA表達，與上述研究一致。

本研究同時發現，TSRDN可以顯著抑制RUNX2和BMP2 mRNA的表達，提示Nrf2/ARE信號通路的激活可能通過抑制成骨分化標記而抑制VC。VSMCs的成骨分化在鈣化發展中起著重要作用，RUNX2是BMP2途徑的主要靶蛋白，它是骨生成的調節劑，對調節骨特異性基因的表達至關重要〔22〕。相反，BMP2信號傳導刺激p300介導的RUNX2乙酰化，從而增加反式激活活性并抑制Smad泛素調節因子(Smurf)1介導的RUNX2降解〔23〕。因此，可以看出這兩種蛋白質在基因表達水平上彼此之間有很大的依賴性，證明BMP2/RUNX2信號通路中蛋白質的表達與VC的嚴重程度密切相關。研究還表明，Nrf2與ARE的結合過表達可能會干擾RUNX2及其下游靶標，從而影響細胞分化過程。此外，Nrf2通過抑制某些關鍵調節蛋白(例如RUNX2)抑制成骨細胞分化和礦化〔24〕。這與RUNX2缺乏抑制VC發生的平滑肌細胞有關。

綜上所述，TSRDN能改善CKD大鼠腎功能和鈣磷代謝，抑制VC，其機制可能與TSRDN激活Nrf2/ARE通路有關。由于VC發病機制復雜，對于TSRDN抑制VC的具體作用機制還有待進一步研究來論證。