漢黃芩苷對潰瘍性結腸炎大鼠促炎因子、氧化應激標志物水平的影響及黏膜修復作用

張霞 杜文澤 趙漢清 張碩

(河北北方學院附屬第二醫院 1消化內科 河北 張家口 075100；2超聲科；3中醫科；4手術室)

潰瘍性結腸炎(UC)病變主要局限于結腸黏膜及黏膜下層，多累及乙狀結腸、直腸，嚴重者可危及整個結腸，其病因復雜，涉及多種飲食、感染、環境等因素〔1，2〕。UC臨床上一般表現為腹瀉、腹痛、黏液性膿血便、里急后重，病理以結腸潰瘍糜爛為主，伴有連續性、淺表性、彌散性特點，病程長，且易復發〔3，4〕。目前臨床上治療UC多采用生物制劑、免疫抑制劑、氨基水楊酸制劑、糖皮質激素、抗生素等，療效不佳，副作用多，且復發率高，嚴重影響患者生活質量〔5〕。漢黃芩苷是黃芩的主要成分之一，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗氧化等藥理作用〔6，7〕。目前尚未有漢黃芩苷治療UC的相關報道，本研究構建UC大鼠模型，考察不同劑量漢黃芩苷對UC大鼠癥狀緩解情況及對炎癥因子、氧化標志物水平的影響。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 漢黃芩苷(貨號：B20488，規格20 mg，純度≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司；柳氮磺胺吡啶(SASP)腸溶片(國藥準字H31020450，批號：20190106)購自上海中西三維藥業有限公司；過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，貨號分別為A007-1-1、A005-1-2、A044-1-1、A001-1、A003-1；白細胞介素(IL)-1β、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，貨號分別為E-EL-R0012c、E-EL-R0016c、E-EL-R0019c；XSP-9CA型生物顯微鏡購自上海光學儀器廠。

1.2實驗動物及模型制備 雄性Wistar大鼠(SPF級)購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，7周齡，體重220～250 g，許可證號：SYXK(粵)2018-0001。適應性飼養1 w后根據Morris等〔8〕方法建立UC大鼠模型：建模前均禁食禁水1 d，以4 mg/100 g劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉以麻醉大鼠，用14號導尿管(直徑2 mm、長15 cm)一次性將2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS,100 mg/kg)和0.25 ml乙醇溶液緩緩注入距大鼠肛門約8 cm深的腸腔內，注入完成后捏緊肛門，并倒置5 min，術后常規飼養。實驗分為對照組(該組大鼠采用同樣方法注入等體積的生理鹽水)；將UC模型大鼠分為UC模型組；SASP組(0.67 g/kg)〔9〕；低劑量漢黃芩苷(25 mg/kg)組；中劑量漢黃芩苷(50 mg/kg)組；高劑量漢黃芩苷(100 mg/kg)組〔10〕，每組10只。造模后第2天開始以2 ml給藥體積灌胃給藥，對照組灌胃等體積生理鹽水，1次/d，連續給藥7 d。

1.3各組大鼠一般情況 治療期間觀察各組狀態及大便情況，根據疾病活動指數(DAI)評分，評分標準參照Arab等〔11〕所描述的標準進行，詳細標準如下：0分：體重減少<1%：大便正常，潛血陰性；1分，體重減少≥1%且<5%；2分：體重減少≥5%且<10%，出現軟便，且潛血陽性；3分：體重減少≥10%且<15%；4分：體重減少≥15%，出現溏便和肉眼可見的血便。

1.4樣本采集和保存 最后一次給藥24 h后，脫頸處死各組大鼠，沿腹部刨開，取出距肛門約8 cm處結腸，采用雙盲法肉眼觀察各組大鼠結腸病理損傷情況，記錄并參照Galvez等〔12〕所描述的標準進行評分，評分標準：無損傷0分；充血但無潰瘍1分；1處線性潰瘍但是無明顯炎性反應2分；1處線性潰瘍和炎性反應3分；2處或多處潰瘍或炎性反應，直徑<1 cm 4分；2處或以上潰瘍及炎性反應，直徑>1 cm 5分。將結腸組織置于10%多聚甲醛固定，剩余結腸組織儲存于-80℃冰箱中待后續檢測。

1.5各組大鼠促炎因子、氧化應激標志物檢測 從-80℃冰箱中取出結腸組織，加入適量緩沖液，4℃條件下勻漿，隨后離心取上清液進行測定。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定結腸組織中IL-1β、IL-10、TNF-α水平；生化法檢測結腸組織中CAT、GSH-Px、MPO、SOD、MDA水平，操作步驟均按照試劑盒說明書執行。

1.6各組大鼠結腸組織蘇木素-伊紅(HE)染色 將固定好的各組大鼠結腸組織取出，置于生物脫水機行逐級脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，連續切片(厚度約4 μm)，行常規HE染色，封片后用光鏡觀察各組結腸組織病理變化。

1.7統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行方差分析，兩組比較行SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠一般情況比較 大鼠造模24 h后可見黏液性稀便，部分可見便血，毛發無光澤、精神萎靡、飲食減少、懶動，說明UC模型大鼠構建成功。經治療后，低、中劑量漢黃芩苷組大鼠稀便及血便癥狀稍緩解，毛色略顯晦暗無光澤；高劑量漢黃芩苷組和SASP組稀便及血便癥狀明顯緩解，毛色恢復光亮。與對照組〔(0.00±0.00)分〕相比，UC模型組DAI評分顯著升高〔(9.41±0.92)分，P<0.05〕；經漢黃芩苷治療后，隨著給藥劑量增高，DAI評分依次降低〔(8.95±0.89)分、(7.93±0.82)分、(5.53±0.54)分，P<0.05〕；高劑量漢黃芩苷組DAI評分與SASP組〔(5.86±0.71)分〕差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2各組結腸組織宏觀損傷情況比較 肉眼可見UC模型組大鼠結腸潰瘍表淺多且大，黏膜嚴重糜爛；經治療后，結腸潰瘍數量、面積減少，程度減輕，黏膜損傷情況有所緩解，且癥狀改善程度與漢黃芩苷劑量呈正相關。與對照組〔(0.00±0.00)分〕相比，UC模型組宏觀損傷評分顯著升高〔(4.52±0.61)分，P<0.05〕；經漢黃芩苷治療后，隨著給藥劑量增高，宏觀損傷評分依次明顯降低〔(4.02±0.44)分、(3.36±0.52)分、(2.51±0.27)分，P<0.05〕；高劑量漢黃芩苷組宏觀損傷評分與SASP組〔(2.72±0.34)分〕差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3各組結腸組織中IL-1β、IL-10、TNF-α、CAT、GSH-Px、MPO、SOD、MDA水平比較 與對照組相比，UC模型組、SASP組、漢黃芩苷各劑量組IL-1β、TNF-α、MPO、MDA水平顯著升高，IL-10、CAT、GSH-Px、SOD水平明顯降低(P<0.05)；經漢黃芩苷治療后，隨著給藥劑量增高，IL-1β、TNF-α、MPO、MDA水平依次明顯降低(P<0.05)，IL-10、CAT、GSH-Px、SOD水平依次明顯升高(P<0.05)；高劑量漢黃芩苷組IL-1β、IL-10、TNF-α、CAT、GSH-Px、MPO、SOD、MDA水平與SASP組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組結腸組織中IL-1β、IL-10、TNF-α、CAT、GSH-Px、MPO、SOD、MDA水平比較

2.4各組結腸組織HE染色結果比較 對照組結腸黏膜完整，未見炎癥損傷，肌層排列整齊，腺體結構正常，未見充血；UC模型組結腸黏膜均有明顯炎癥損傷、變薄，大量炎性細胞浸潤，肌層結構紊亂，腺體充血、水腫；經漢黃芩苷治療后，隨著給藥劑量增高，結腸黏膜、肌層、腺體病變損傷明顯緩解；高劑量漢黃芩苷組癥狀緩解情況與SASP組相當。見圖1。

圖1 各組結腸組織HE染色(×200)

3 討 論

UC在中醫學上屬于“休息痢”“泄瀉”“痢疾”等范疇，該病機以血熱妄行、濕熱蘊結大腸為主〔5〕。目前多認為促炎因子和抑炎因子、氧化介質和抗氧化介質之間的平衡紊亂是其主要病因，而漢黃芩苷具有抗炎、抗氧化的藥理作用。

研究發現，漢黃芩苷能夠抑制Toll樣受體(TLR)4介導的核轉錄因子(NF)-κB炎癥信號通路活性，從而發揮抗炎作用，以緩解LPS誘導的急性肺損傷癥狀〔13〕。此外漢黃芩苷可抑制NOD樣受體蛋白3炎癥小體(NLRP3)和NF-κB活化以發揮抗炎作用，緩解3，3′-二甲氧基聯苯胺鹽酸鹽(DSS)誘導的結腸炎癥狀〔14〕。葉圣榮等〔15〕研究發現漢黃芩苷能夠下調MDA水平，上調SOD、還原性谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮合酶(iNOS)水平以抑制腎缺血/再灌注損傷大鼠氧化應激反應，保護腎功能。本研究說明漢黃芩苷能夠緩解UC癥狀，對UC有一定的治療效果。行結腸組織宏觀損傷分析發現，UC模型組大鼠結腸潰瘍表淺多且大，黏膜嚴重糜爛；經漢黃芩苷治療后，結腸潰瘍數量、面積減少，程度減輕，黏膜損傷情況有所緩解，隨著給藥劑量增高，宏觀損傷評分依次降低，說明漢黃芩苷能夠保護UC大鼠結腸組織，促進黏膜修復。病理學HE染色結果同樣說明，經漢黃芩苷治療后，隨著給藥劑量增高，結腸黏膜、肌層、腺體病變損傷明顯緩解。炎癥因子異常表達與UC相關，UC活動期大量單核-巨噬細胞聚集于結腸黏膜，合成并釋放大量IL-1β，引起結腸黏膜炎癥反應，從而導致黏膜組織破壞〔16〕。IL-10作為抑炎因子，可抑制單核細胞和巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子，維持正常腸道黏膜免疫調節〔17〕。TNF-α主要表達在淋巴細胞、中性粒細胞和巨噬細胞的胞質中，能夠使中性粒細胞聚集、發生呼吸爆發、脫顆粒等參與UC病程〔18〕。本研究結果說明，漢黃芩苷能夠下調促炎因子IL-1β、TNF-α水平，上調抑炎因子IL-10水平以抑制UC大鼠炎癥反應。SOD可清除機體超氧化物陰離子，具有抗氧化作用，當其含量降低時，導致自由基累積，MDA作為質子過氧化物最終產物能夠間接反映氧化應激程度，因此測定SOD、MDA水平可反映機體氧化應激程度〔19〕。CAT位于細胞的過氧化體中，作為抗氧化系統中酶系統的重要組成部分，能夠與SOD協同清除自由基，保護機體免受損害，可作為評價機體的抗氧化能力〔20〕。GSH-Px作為過氧化氫酶，在機體中分布廣泛，可保護細胞膜功能和結構免受過氧化氫的氧化損傷〔21〕。MPO是由中性粒細胞產生的過氧化物酶，一般分布在單核細胞和嗜中性粒細胞中，其水平可反映中性粒細胞浸潤程度〔22〕。本研究說明漢黃芩苷可調節氧化因子和抗氧化因子平衡，拮抗氧化應激進程。