苯丙氨酸羥化酶缺乏癥家系PAH基因新發突變分析

馬翠霞，封露露，李麗欣，馬倩倩，李 揚，封紀珍

(1.石家莊市婦幼保健院 a.遺傳科；b.產前診斷科，河北 石家莊 050000；2.石家莊市婦產醫院 體檢中心，河北 石家莊 050000)

苯丙氨酸羥化酶缺乏和四氫生物蝶呤缺乏都會造成機體苯丙氨酸含量增高，引起高苯丙氨酸血癥(hyperphenylalaninemia，HPA)[1]。有研究顯示，我國新生兒疾病篩查中近90%的HPA病因為苯丙氨酸羥化酶缺乏癥(phenylalanine hydroxylase deficiency，PAHD)[2]。而PAHD臨床表型復雜，新生兒期表現正常，出生后3～4個月皮膚逐漸變白，頭發逐漸變黃，汗液、尿液有特殊的鼠臭味，同時也會表現行為、神經異常，對患兒智力造成的損害是永久性的，由于患兒缺乏典型的癥狀，可能會被誤診為神經系統疾病[3]。PAHD的病因是苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)基因發生突變，且PAH基因突變位點在不同區域、種族間存在明顯的差異[4-5]。本研究應用二代測序技術(next generation sequencing, NGS)和多重連接探針技術(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)對PAHD患兒及其父母基因組進行測序，尋找PAH基因突變位點并進行分析，旨在為PAHD家庭的遺傳咨詢提供有效的依據。

1 資料與方法

1.1病例選擇 此PAHD家系由石家莊市新生兒疾病篩查診治分中心收集，共3名成員，先證者為女性，確診時出生45天，家系情況見圖1。本研究經醫院倫理委員會批準，所有受試對象均簽署了相關的知情同意書。

圖1 PAHD家系圖

1.2基因測序

1.2.1提取DNA 使用德國Qiagen試劑盒提取受檢者靜脈血中DNA，并且使用Nanodrop 2000分光光度計進行質檢，若DNA質量等級為D級則不合格，不能進行基因組文庫構建。鑒定按照以下標準：①DNA濃度≥30 ng/μl時，1.7≤OD260/280吸收的比值(a)<2.0，質量等級為A級；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3，質量等級為B級；a<1.5或a>2.3，質量等級為C級。②20 μg/ml≤DNA濃度<30 μg/ml 時，1.7≤a<2.0，質量等級為B級；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3，質量等級為C級；a<1.5或a>2.3，質量等級為D級。③DNA濃度<20 μg/ml 時，質量等級均為D級。

1.2.2構建文庫 采用Covaris打斷法將檢測樣本打碎為小分子片段(100～700 bp)，將小片段DNA末端進行加“A”修復，并對產物進行純化。配置反應體系，充分混勻離心后98 ℃預變性1個循環2 min，98 ℃變性8個循環30 s，65 ℃退火8個循環30 s，72 ℃延伸8個循環30 s，最后72 ℃延伸1個循環5 min。對擴增產物進行純化質檢，若DNA質量等級為D級則不合格，不能進行下一步。鑒定按照以下標準：①DNA濃度≥50 μg/ml 時，1.7≤a<2.0，質量等級為A級；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3，質量等級為B級；a<1.5或a>2.3，質量等級為C級。②30 μg/ml ≤DNA濃度<50 μg/ml 時，1.7≤a<2.0，質量等級為B級；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3，質量等級為C級；a<1.5或者a>2.3，質量等級為D級。③DNA濃度<30 μg/ml 時，質量等級為D級。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳于200～500 bp處呈現清晰條帶則建庫成功。

1.2.3捕獲目的區域 標記生物素的探針與文庫DNA雜交，60 ℃孵育16 h以上，雜交后的探針共價結合鏈霉親和素修飾的磁珠，磁珠及攜帶的目的基因經過磁力架的吸附作用達到洗脫純化富集目的基因的目的。

1.2.4上機測序 采用“橋式”擴增反應，NextSeq 500對加載到Flowcell測序芯片上的文庫自動循環，采用末端可逆邊合成邊測序的方式，并對不同標記的核苷酸測序，根據標記的不同熒光信號確認堿基種類，經過數個循環后讀取完整的核酸序列，最終保證核酸序列質量。

1.2.5生物信息分析 統計讀取次數數量和測序質量，將處理后的數據與人基因組(hg19)進行排序、比對、過濾，去除冗余讀取次數，降低假陽性。對插入缺失標記(Indel)附件中讀取次數重新比對，消除周邊假陽性單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)。通過重新計算堿基質量值，對堿基進行糾正，之后將SNP和Indel結果關聯到多個數據庫，進行注釋、解析。

1.2.6基因突變位點生物信息分析 根據美國醫學遺傳學與基因組學學會(America College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南對基因測序檢測到的突變位點進行致病性分析，對于未報道的位點，使用SIFT、PolyPhen_2、REVEL等軟件進行生物信息預測。

1.3MLPA 使用DNA提取試劑盒提取受試者核酸，并對提取的DNA進行質檢，若DNA質量等級為D級則不合格，不能進行下一步。鑒定按照以下標準：①DNA濃度≥30 μg/ml時，1.7≤OD260/280吸收的比值(a)≤2.0及2.02.3及1.0≤b≤2.0，質量等級為C級。②21 μg/ml≤DNA濃度<30 μg/ml時，1.7≤a≤2.0及1.0≤b≤2.0，質量等級為B級；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3及1.0≤b≤2.0，質量等級為C級；a<1.5或a>2.3及b<1.0，質量等級為D級。③DNA濃度≤20 μg/ml時，質量等級均為D級。DNA質檢符合要求后變性，加入探針混合液和MLPA緩沖液，孵育雜交。產物與連接酶混合液孵育連接，加熱使酶失活。然后加入引物、dNTP和DNA聚合酶進行反應，最終將擴增片段長度和結果峰導入軟件并分析結果。

2 結 果

2.1PAH基因測序 先證者PAH基因測序結果顯示：第6外顯子c.630T>G和第2外顯子c.61-1G>A。其中c.630T>G為錯義突變，這一突變使PAH基因第210號所編碼的氨基酸發生改變，苯丙氨酸變為亮氨酸 (p.F210L)；c.61-1G>A為剪接突變。這兩個突變位點在正常人群數據庫為低頻變異，在人類基因突變數據庫(Human Gene Mutation Database, HGMD)中未見報道，見圖2～3。

圖2 PAHD患兒PAH基因外顯子6中c.630T>G錯義突變(箭頭處為基因突變位置)

圖3 PAHD患兒PAH基因外顯子2中c.61-1G>A剪接突變(箭頭處為基因突變位置)

2.2生物信息及致病性分析 使用軟件SIFT、PolyPhen_2、REVEL對c.630T>G進行預測分析，分別為良性、有害、有害；對c.61-1G>A進行預測分析，分別為未知、未知、未知。C.630T>G為錯義突變，Sanger驗證家系分析顯示，先證者之父此位點雜合變異，其母無變異，ACMG指南初步判定其為臨床意義未明突變。c.61-1G>A為剪接突變，家系分析顯示先證者之父此位點無變異，其母雜合變異，ACMG指南初步判定其突變為疑似致病性突變。

2.3氨基酸的保守性分析及蛋白質的三維結構預測 通過模式生物保守性分析，PAH基因第210號編碼的苯丙氨酸在人、黑猩猩、獼猴、家犬、黃牛、小白鼠、褐家鼠、雞、斑馬魚、果蠅、岡比亞按蚊、秀麗隱桿線蟲、熱帶爪蟾中高度保守，見圖4。蛋白質三維分子結構預測PAH基因突變型NM＿000277 c.630T>G(p.F210L)第210號氨基酸附近氫鍵明顯減少，由苯丙氨酸變為亮氨酸，見圖5。

圖4 不同物種中PAH基因第210號編碼的苯丙氨酸位點保守性

圖5 PAH基因蛋白三維分子結構預測分析 a.野生型PAHp.F210L; b.突變型PAHp.F210L

2.4MLPA結果 MLPA檢測電泳峰圖顯示先證者的PAH基因外顯子未發現拷貝數異常，見圖6。

圖6 MLPA檢測電泳峰圖 a.對照樣本；b.先證者

3 討 論

HPA是苯丙氨酸在代謝過程中PAH或其輔酶缺乏造成苯丙氨酸增高的一種代謝性疾病。隨著篩查技術的不斷提高，PAHD患兒的診斷由臨床癥狀逐步轉變為生物化學及基因診斷，其中基因診斷是HPA的確診方法。PAHD具有復雜的臨床表型，迄今為止，國際上已經報告多達1 000種PAH基因突變類型，在我國人群中有100余種[6-7]。不同地區、不同人群中PAHD的發病率和突變位點均有很大差異[8]，我國也是如此，不同地區、人群的基因突變需要進一步驗證[9-11]。有研究顯示，我國北方漢族人群PAH基因突變的情況與其他民族存在差異[12]，突變位點在不同地區中也有所不同。青島PAH基因的突變熱點主要為c.728G>A、c.1068C>A、c.158G>A[13]；鄭州主要為c.728G>A、c.331C>T、c.611A>G[14]；唐山主要為c.728G>A、c.331C>T、c.782G>A[15]；而在我國南方一些地區，如安徽PAH基因的突變熱點主要為c.728G>A、c.158G>A、c.611A>G[16]，四川主要為c.728G>A、c.721C>T、c.611A>G[17]，以上分析結果顯示各個地區PAH基因突變位點不完全相同但又存在一定的聯系。

本研究PAHD患兒的突變方式為錯義突變和剪接突變，突變位點在第6外顯子和第2外顯子：630號核苷酸由胸腺嘧啶變為鳥嘌呤(c.630T>G)的錯義突變，使第210號氨基酸發生明顯的改變。ACMG 指南對此突變判定為臨床意義未明，在ESP、EXAC和千人數據庫正常對照人群中未發現的變異。通過對先證者父母驗證，發現在PAH基因反式位置檢測到致病突變。先證者表型與單基因遺傳病高度符合，采用SIFT、PolyPhen_2、Mutation Taster軟件分析該突變位點位于PAH蛋白的高度保守區，氨基酸的變化導致蛋白質功能發生改變從而致病，預測軟件REVEL預測此突變有害，HGMD數據庫沒有相關報道。c.61-1G>A為零效變異，導致氨基酸發生明顯改變，ACMG指南判定為疑似致病性變異，這一突變可能導致基因功能喪失，在ESP、EXAC和千人數據庫正常對照人群中未發現此變異；軟件REVEL預測為未知，HGMD數據庫沒有相關報道。c.61-1G>A的剪接突變因外顯子剪接位點發生改變使對應的外顯子縮短、丟失，SIFT、PolyPhen_2和REVEL蛋白功能預測軟件對此剪接突變預測結果均為未知，然而這一突變對人體的影響仍需要進一步的研究、分析、確認[18]。第6外顯子編碼的氨基酸位于蛋白質的活性中心，所以這個區域發生大片段缺失時會嚴重影響酶的活性，然而發生片段缺失的患兒較少，需要擴大樣本量進行深入研究[19]。

對基因功能改變影響較大的突變有致病突變，反之為沉默突變。致病突變能夠嚴重影響基因編碼的氨基酸生物合成各個環節以及蛋白質的結構，進一步對PAH催化活性產生影響。而發生沉默突變的基因堿基發生的改變可能使氨基酸發生改變，但不會影響蛋白質的活性和功能。NGS能夠檢測點突變和小片段缺失、插入，而MLPA雖然不適用于檢測未知點突變，但對缺失的大片段、重排能夠很好的檢出，這兩種技術聯合使用可有效提高檢測準確率。

疾病相關基因測序發現，本研究PAHD患兒存在與疾病表型相關的疑似致病性突變，經基因測序確診為PAHD，血苯丙氨酸濃度為2.4 mg/dl，診斷為輕度HPA，定期監測苯丙氨酸濃度，最高為4.2 mg/dl。《高苯丙氨酸血癥的診治共識》[20]指出，輕型HPA的治療可以暫緩，但是要定期監測血苯丙氨酸濃度，如果兩次連續血苯丙氨酸濃度>6.0 mg/dl(360 μmol/L)，應進行低苯丙氨酸治療，治療后3～6個月對患兒進行生長發育評估，1歲、2歲、3歲、6歲時進行智能發育評估，使其體格、智力接近或達到正常兒童的發育水平。在患兒感染一些疾病，如膿毒血癥、創傷和慢性腎功能衰竭時，需要嚴密監測血苯丙氨酸濃度，可根據血苯丙氨酸濃度調整臨床治療方案[20]。如果后期對患兒進行治療，尤其需要注意避免過度治療造成苯丙氨酸缺乏。苯丙氨酸作為人體必需的一種氨基酸，如果缺乏會造成皮膚損害、營養不良、低蛋白血癥等，甚至危及生命[21]。通過早期篩查、規范治療，可以使患兒發育達到或接近正常兒童的水平。

本研究闡明了一個輕度HPA家系的未報道致病基因突變，擴大了石家莊市苯丙酮尿癥尤其是輕度HPA患兒PAH基因的突變譜，對了解該病的發生、發展以及患兒家庭的遺傳咨詢提供有力的支持，對于c.61-1G>A影響PAH基因的作用機制也需要深入的研究。