2種冷凍時長進行液氮冷凍法犬股骨頭壞死造模的效果比較

樓鵬強，鄧小磊，魏波，湯朔，侯德才

(遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032)

股骨頭壞死是骨科常見的難治性疾病[1]。建立有效的動物模型，對于探索股骨頭壞死的發生機制和新的治療方法均有重要意義。目前用于股骨壞死造模的實驗動物和造模方法較多，其中以液氮冷凍法制備的犬股骨頭壞死模型應用最為廣泛[2-5]。但對于造模過程中液氮冷凍的最佳時長，目前尚未見到相關研究。因此，本研究選擇文獻報道的4 min[6]和8 min[7]2種冷凍時長進行了對比研究，現總結報告如下。

1 材料與儀器

1.1 試驗動物SPF級健康成年雄性比格犬12只，年齡17～23個月，體質量10.1～12.2 kg。所有犬均購自沈陽康平實驗動物研究所，實驗動物許可證號SCXK(遼)2014-0003。所有犬均在面積3 m2的犬舍中單獨飼養，允許自由活動。實驗方案通過遼寧中醫藥大學附屬醫院動物實驗倫理委員會批準(21000092019051)。

1.2 主要試劑硫酸阿托品注射液(安徽長江藥業有限公司，國藥準字H34021900)，鹽酸塞拉嗪注射液(長沙拜特生物科技研究所有限公司，獸藥字180121777)，舒泰50(法國維克，批號：83887902)，注射用頭孢美唑鈉(山東羅欣藥業集團股份有限公司，國藥準字H20103440)，戊巴比妥鈉(德國默克，批號：W-20180223)，乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)脫鈣液(北京索萊寶科技有限公司)，HE染色試劑盒(碧云天生物技術有限公司)。

1.3 主要設備GE-D8000 X線機，GE Signa 1.5T超導MRI系統，Nikon MODEL YS100生物顯微鏡。自制液氮冷凍裝置，該裝置由包納股骨頭、保護周圍組織的工作套筒和引流液氮的導軌2部分組成；其中工作通道由去除針頭端的5 mL注射器外套制成，導軌由去除針頭端的5 mL注射器外套縱向剖開后制成；使用時將導軌插入工作通道內(圖1)；使用前，將液氮冷凍裝置于液氮中進行預冷；以上操作均在無菌條件下完成。

2 方 法

2.1 動物分組及造模將12只動物隨機分為冷凍8 min組和冷凍4 min組，每組6只。按0.1 mL·kg-1肌肉注射硫酸阿托品注射液，以減少麻醉過程中動物呼吸道腺體分泌；15 min后，按0.05 mL·kg-1肌肉注射鹽酸塞拉嗪注射液進行誘導麻醉；15 min后，按 0.05 mL·kg-1肌肉注射舒泰50，術中按0.025 mL·kg-1給藥維持麻醉。麻醉成功后，消毒，剃除犬左髖部約10 cm×16 cm的毛發，以碘伏消毒后，鋪無菌手術單及洞巾。以大轉子為中心在股骨干前緣弧形切開，切口近端始于近背中線處，遠端止于股骨近端1/3～1/2處。分離皮下組織，在股骨干前外側找到股二頭肌與股筋膜、闊筋膜張肌的結合部，沿著股二頭肌前緣切開，將闊筋膜張肌切斷。分離暴露“股三角區”(背側為臀中肌、臀深肌,外側為股外側肌,內側為股直肌)[8]，向后拉開臀中肌和股二頭肌，向上拉開闊筋膜和闊筋膜張肌，部分分離臀中肌和股外側肌的附著部。鈍性分離關節囊上附著的脂肪，暴露關節囊。順著股骨頸方向剪開關節囊，向遠端分離，暴露股骨頭。向外旋轉股骨，用彎剪伸到關節囊內剪斷圓韌帶，將預制好的液氮冷凍裝置套在股骨頭上，用紗布包繞冷凍裝置以保護周圍組織。沿導軌緩慢注入液氮，2組分別持續冷凍4 min和8 min。冷凍結束后，以生理鹽水復溫3 min左右，以肉眼觀察到的股骨頭表面顏色從蒼白恢復至接近冷凍前狀態作為復溫結束的標志。閉合關節囊，將分離的肌肉恢復至原位并逐層縫合，關閉切口，術區覆蓋無菌敷料后送回犬舍。術后7 d內，每天按0.1 mL·kg-1肌肉注射頭孢美唑鈉。造模手術由2名有豐富髖關節手術經驗的醫生完成。

2.2 造模結果評價造模手術后觀察并記錄動物的飲食、活動、精神狀態、切口愈合等一般情況。造模后9周，進行X線和MRI檢查，并以MRI影像作為判斷股骨頭壞死的標準，即T1WI上股骨頭出現線樣低信號區或T2WI上股骨頭出現“雙線征”[9]。影像學檢查結束后，按100 mg·kg-1靜脈注射戊巴比妥鈉處死動物，取出造模側股骨頭，觀察股骨頭表面軟骨及股骨頭塌陷情況。股骨頭標本大體觀察結束后，將股骨頭樣本置于10%多聚甲醛中固定2 d，以14%EDTA脫鈣4周，石蠟包埋后冠狀位切片，厚度3 μm，HE染色后在顯微鏡下觀察。

3 結 果

3.1 一般情況至最終處死前，2組均無動物死亡。造模手術后2 d內，所有動物均開始出現飲食減少、精神萎靡、活動減少等表現。冷凍4 min組動物的上述表現均在1周內改善；冷凍8 min組動物的上述表現約在2周后逐步恢復正常，切口愈合緩慢，而且均出現了跛行現象。冷凍8 min組的1只動物在造模手術后第3天出現術區皮膚紅腫，造模手術后1周時出現對應部位皮膚組織壞死及化膿，造模手術后4周時愈合。

3.2 影像學檢查結果

3.2.1X線檢查結果 冷凍8 min組動物造模側股骨頭均出現了不同程度的變化，如骨質硬化、關節間隙變窄，但變化不明顯，且部分動物的股骨頭出現了囊性變[圖2(1)]；冷凍4 min組僅2只動物的股骨頭出現了輕微的骨質硬化[圖2(2)]。

白色箭頭指示處顯示關節間隙變窄;藍色箭頭指示處為骨質硬化區域;黃色箭頭指示區域為囊性變。

3.2.2MRI檢查結果 冷凍8 min組所有動物T2WI上均可見股骨頭骨髓水腫和關節腔積液表現[圖3(1)]，T1WI上均可見線樣低信號[圖3(2)]，均達到股骨頭壞死標準；冷凍4 min組4只動物T2WI上可見股骨頭骨髓水腫和關節腔積液表現，其余2只動物的T2WI上僅可見關節腔積液表現[圖3(3)]，T1WI上均無明顯改變[圖3(4)]。

藍色箭頭指示處為骨髓水腫;白色箭頭指示處為關節腔積液;黃色箭頭指示處為線樣低信號區域。

3.3 大體觀察結果冷凍8 min組股骨頭扁平、表面較粗糙，部分股骨頭出現軟骨裂紋，部分股骨頭軟骨磨損嚴重[圖4(1)]；冷凍4 min組股骨頭形態無明顯改變，表面較光滑，僅部分動物的股骨頭出現了軟骨裂紋或輕微軟骨磨損[圖4(2)]。

黃色箭頭指示處可見股骨頭扁平;白色箭頭指示處為軟骨裂紋;紅色箭頭指示處為軟骨磨損處。

3.4 病理學檢查結果冷凍8 min組股骨頭組織骨陷窩內大部分骨細胞核消失，同時可見骨小梁斷裂[圖5(1)]；冷凍4 min組股骨頭組織大部分骨陷窩內可見骨細胞核，骨小梁完整[圖5(2)]。冷凍8 min組股骨頭組織空骨陷窩率高于冷凍4 min組[(20.21±2.6)%，(13.51±3.1)%，t=4.055，P=0.002]。

綠色箭頭指示處為空骨陷窩;黃色箭頭指示處為斷裂的骨小梁;藍色箭頭指示處為含有細胞核的骨陷窩。

4 討 論

目前，進行犬股骨頭壞死造模的方法很多。激素法易導致犬出現全身并發癥，且造模成功率較低[10]，因此較少應用。創傷法通過造成股骨基底部骨折，阻斷股骨頭血供誘導股骨頭壞死，但造模手術操作困難，可重復性較差[11]。酒精法通過從股骨大轉子向股骨頭建立通道，并向股骨頭內注射乙醇，以誘導股骨頭壞死的發生，但該方法需破壞股骨頭的結構，同時操作較為困難[12-13]。液氮冷凍法與人類股骨頭壞死的病理生理學過程相似，而且具有較好的可重復性[14]。

股骨頭局部經液氮冷凍后，骨細胞發生壞死，同時液氮冷凍也導致股骨頭毛細血管內皮細胞受損、內外源性凝血機制激活，引起毛細血管微血栓形成，最終導致股骨頭區域內小血管發生梗阻[15]。此外，液氮冷凍后，血管通透性增加，進而發生血液黏度增加、血液流速減緩等一系列變化，導致股骨頭內靜脈淤滯，骨內壓增高，并加重股骨頭內缺血。而股骨頭復溫后，血管再通，也可導致股骨頭發生缺血性再灌注損傷[16]。

本研究中冷凍8 min組1只動物出現了術區皮膚壞死，這可能是液氮冷凍時間較長，導致周圍皮膚組織凍傷所致。因此在進行液氮冷凍的操作時，應當注意保護好周圍組織。我們在實驗中用注射器制作的液氮冷凍裝置，其工作通道的半徑略大于犬股骨頭的半徑，正好容納犬的股骨頭，可以控制液氮冷凍的范圍，同時以紗布包繞冷凍裝置，很好地保護了周圍組織。感染是髖關節手術中最嚴重的并發癥之一。實驗中使用的冷凍裝置均在無菌條件下完成，從而有效避免了感染的發生。

本研究的結果提示，以液氮冷凍法進行犬股骨頭壞死造模時，液氮冷凍8 min的造模成功率高于液氮冷凍4 min。