采用CRISPR /Cas9系統構建HIF-1α基因敲除質粒及功能驗證*

陳年杰，洪裕程，沈 悅，王進濤，鐘良軍，△

(1.杭州師范大學醫學部口腔醫學院，浙江 杭州 311121；2.杭州師范大學附屬醫院口腔醫學中心，浙江 杭州 310015)

缺氧是一種常見的致傷因素，對機體炎癥性疾病的發生、發展具有重要的調節作用。機體對炎癥組織中缺氧的適應性反應是通過激活和積累缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)來進行。HIF-1α是一種異源二分轉錄因子，是在缺氧條件下可發揮生物活性的唯一一種特異性轉錄因子，在調控基因表達以維持氧穩態方面起著重要作用[1]。常氧條件下，HIF-1α亞基通過細胞內氧依賴性泛素蛋白酶快速降解。然而，在低氧條件下，HIF-1α亞基的降解被抑制，并與HIF-1β形成異源二聚體，轉移到細胞核中調節多種基因的轉錄[2]。HIF-1α被認為是許多疾病的影響因素，可以調節促炎基因的表達，HIF-1α蛋白在牙周炎患者牙齦組織中的表達已被證實[3]。HIF-1α與心血管疾病也有密切關系。有研究發現[4],HIF-1α通過使血管增生參與動脈粥樣硬化的發生、發展，后繼研究發現斑塊內新生血管生成與斑塊內出血、破裂和炎性浸潤密切相關。

簇狀規則間隔短回文重復序列(CRISPR)/Cas9是細菌和古細菌形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9是繼鋅指核酸酶(ZFNs)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)等基因編輯技術推出后的第三代基因編輯技術，在短短數年內便風靡全球,成為現有基因編輯和基因修飾里效率最高、最簡便、成本最低、最容易上手的技術之一，也是當今最主流的基因編輯系統。人胚胎腎細胞293(HEK-293細胞)具有轉染高效性、易于培養等特點，是一種常用的表達研究外源基因的細胞株。本實驗擬利用CRISPR/Cas9技術構建質粒并敲除HEK-293細胞的HIF-1α基因，為進一步探索和證實HIF-1α功能及后續研究打下基礎。現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 HEK-293細胞株(CRL-1573)購于美國模式培養物集存庫；Stbl3感受態細胞、LentiCRISPR V2質粒(ZK611)購于北京莊盟生物基因科技有限公司；轉染試劑Lipofectamine 3000、Opti-MEM培養基購于美國賽默飛世爾科技公司；DMEM高塘培養液購于美國Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒、細胞DNA提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司;BsmBI限制性核酸內切酶、T4 DNA Ligase、T7E1核酸內切酶購于美國New England Biolabs公司；聚合酶鏈式反應(PCR) mix、嘌呤霉素、Western blotting套裝、qPCR套裝購于上海碧云天公司；HIF-1α抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體購于英國Abcam公司；引物合成委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行。

1.2方法

1.2.1sgRNA設計和載體構建 利用張峰實驗室提供的sgRNA設計網站(http://crispor.tefor.net/)，根據CRISPR/Cas9靶點設計原則，選擇符合實驗要求的sgRNA。在正義鏈模板的5′端添加CACCG;反義鏈模板的5′端添加AAAC及3′端添加C，以便與BsmBI酶切后的線性CRISPR/Cas9質粒載體黏性末端互補。根據HIF-1α蛋白的結構域功能，設計靶向HIF-1α-Exon3的1個sgRNA(表1)，將其命名為HIF-1α-sgRNA。本研究中所設計的sgRNA序列如下。HIF-1α-sgRNA F：5′-CCA CCG TTC TTT ACT TCG CCG AGA TC-3′；HIF-1α-sgRNA R：5′-AAA CGA TCT CGG CAG AAG TAA AGA AC-3′。將序列送生物公司合成單鏈寡聚核苷酸片段(oligos)，經退火形成雙鏈結構片段。BsmBI限制性核酸內切酶酶切LentiCRISPR V2載體產生2個末端，瓊脂糖凝膠電泳，按照瓊脂糖DNA回收試劑盒說明回收大片段。用T4連接酶將oligos和酶切回收的線性LentiCRISPR V2載體連接，連接產物加入Stbl3感受態細胞，經轉化、涂含氨芐抗性的平板，37 ℃恒溫培養箱內過夜。16 h后，挑取3個菌落進行單克隆，置37 ℃恒溫搖床擴增。再次經過16 h后，送部分菌液至生物公司測序驗證，剩余菌液用質粒回收試劑盒提取菌液質粒。將重組質粒命名為LentiCRISPR V2-HIF-1α。

1.2.2細胞嘌呤霉素篩選濃度確定 從恒溫培養箱中取出融合度為70%的HEK-293細胞,沖洗,消化,離心,加入10 mL完全培養基重懸,細胞計數。取1塊干凈無菌的24孔細胞培養板,每孔添加104個細胞,添加6孔，輕輕晃動培養板鋪勻細胞,然后放回細胞培養箱繼續培養24 h。第2天,配置不同濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、8.0 μg/mL)嘌呤霉素的新鮮完全培養基。取出培養24 h后的細胞,棄去原培養基,更換含不同濃度嘌呤霉素的完全培養基,每個濃度設置3個副孔。培養基更換完成后將24孔板放回恒溫細胞培養箱繼續培養,每天觀察,選取48 h后完全殺死HEK-293正常細胞的濃度作為嘌呤霉素篩選的最佳濃度。

表1 引物信息

圖1 sgRNA設計示意圖

1.2.3細胞轉染 將質粒重組LentiCRISPR V2-HIF-1α(5 μg)加入Opti-MEM培養基，再加入P3000試劑配置為質粒混合液，最終體積為250 μL。用240 μL Opti-MEM稀釋10 μL Lipofectamine 3000，制備成Lipofectamine 3000-Opti-MEM稀釋液。將質粒混合液和Lipofectamine 3000-Opti-MEM稀釋液充分混合，室溫下孵育5 min。隨后將轉染體系緩慢逐滴加入生長狀態良好、細胞匯合度為70%～80%的HEK-293細胞中，輕輕晃動混勻，放回二氧化碳培養箱中繼續培養18 h。18 h后吸凈原培養基，加入DMEM完全培養基，繼續在二氧化碳培養箱中培養48 h。細胞轉染48 h后，更換含2 μg/mL puromycin的完全培養基，待對照組細胞完全死亡后，更換含1 μg/mL puromycin的完全培養基，將實驗組陽性細胞擴大培養。

1.2.4DNA提取和T7E1酶切實驗 按照細胞DNA提取試劑盒的使用說明提取細胞DNA，使用設計好的引物(表1)對目的片段進行擴增，采用瓊脂糖凝膠對擴增的目的片段進行回收。取PCR產物5 μL(300 ng)、蒸餾水3 μL、10× T7 buffer 1 μL共9 μL體系，按照95 ℃ 5 min、每秒降低2 ℃到85 ℃、每秒降低0.5 ℃到16 ℃進行退火程序。退火完成后向退火產物中加入1 μL T7E1酶，混勻后37 ℃反應20 min進行酶切反應，反應完成后加入1.5 μL的0.25 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)終止酶切反應。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測切割效果。利用ImageJ軟件進行灰度分析，同時計算打靶效率，計算公式為fcut=(b+c)/(a+b+c)和indel(%)=[1-(1-fcut)1/2]×100。b和c為酶切條帶的灰度值，a為未被酶切條帶的灰度值。

1.2.5Western blotting檢測 將一定數量的正常細胞和實驗細胞接種于六孔板，待細胞融合度達80%時，更換含200 μmol/L氯化鈷的完全培養基。處理8 h后，將六孔板移至冰上操作，棄去培養基，隨即加入200 μL聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液(1×)，用細胞刮刀反復均勻刮擦板底，使細胞充分裂解后轉移至離心管中，隨后立即放到高速離心機內，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。轉移至水浴鍋內100 ℃水浴8 min。配置8%聚丙烯酰胺凝膠，上樣，80 V電泳1.5 h，然后轉膜、封閉1 h，一抗孵育過夜，TBST清洗，二抗孵育1 h，TBST再清洗，最后經增強型化學發光顯影液在化學發光儀中顯影，檢測HIF-1α蛋白表達情況。

1.3統計學處理 采用ImageJ軟件進行灰度分析，數據用GraphPad Prism 7進行繪圖及單因素方差分析(ANOVA)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1LentiCRISPR V2-HIF-1α質粒鑒定 測序結果與所設計的sgRNA序列一致，LentiCRISPR V2-HIF-1α載體質粒構建成功。見圖2。

圖2 質粒構建及測序結果

2.2嘌呤霉素篩選濃度確定 HEK-293細胞在不同濃度嘌呤霉素完全培養基篩選48 h后,濃度大于或等于2.0 μg/mL嘌呤霉素培養基內的細胞均完全死亡,而對照組細胞生長狀態良好。故確定嘌呤霉素水平2.0 μg/mL為細胞生長的最佳篩選濃度。

2.3T7E1酶切實驗及sgRNA打靶效率檢測 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，引物擴增后的PCR產物長度為759 bp，經過T7E1酶切后，形成約250 bp的引物小片段和約500 bp的引物大片段，與設計結果一致。利用灰度分析和相關計算公式得出sgRNA的打靶效率為33.8%。

2.4Western blotting檢測HIF-1α蛋白表達 為進一步驗證經過嘌呤霉素篩選后的混合細胞株HIF-1α蛋白表達情況，用200 μmol/L氯化鈷處理野生型和篩選后的混合細胞株，Western blotting結果顯示，氯化鈷可以誘導野生型細胞的HIF-1α表達，而經氯化鈷誘導的混合細胞株HIF-1α表達明顯降低，說明實驗組的HEK-293細胞HIF-1α被成功敲低。

A：野生型PCR產物；B：混合細胞株PCR產物；M：DNA Maker。用T7E1酶切鑒定，三角形表示T7E1酶從未完全互補配對處切割后產生的2個片段。

A：用200 μmol/L氯化鈷處理野生型(HIF-1α +/+)和混合細胞株(HIF-1α +/-)8 h后，HIF-1α蛋白表達的Western blotting結果；B：ImageJ灰度分析，相對定量統計。**P<0.01；*P<0.05。

3 討 論

缺氧被認為是疾病發生、發展的一個重要致病因素，HIF在調控基因表達以維持氧穩態方面起著重要作用[5]。牙周病是一種炎癥性疾病，會導致牙周組織被破壞，牙根表面的牙菌斑生物膜形成是其主要病因[6]。牙周炎炎性反應部位通常會出現缺氧環境，這是由于牙周組織循環障礙導致周圍氧氣供應減少，炎性反應使細胞密度增加，新陳代謝增強氧氣消耗增加[7]。KING-TUNG等[2]報道了HIF-1α在牙周病灶中的表達增加，支持這些區域存在缺氧環境。SHI等[8]的一項研究表明，HIF-1α在慢性牙周炎不同階段患者牙齦組織中的表達顯著增加。隨著牙周炎癥的發展，HIF-1α在牙周炎患者組織中的免疫反應比牙齦炎和健康對照組更為強烈。這些發現提示，HIF-1α可能在牙周病中起作用。SLUIMER等[9]證實患者頸動脈斑塊內存在缺氧環境,同時該研究表明斑塊內缺氧誘導了HIF-1α和促血管生成因子(VEGF)的表達，HIF-1α表達與斑塊內新生血管形成、巨噬細胞浸潤及斑塊病變進展相關。氯化鈷是目前最常用的HIF-1α誘導劑，主要通過與PAS域結合誘導HIF-1α表達，導致HIF-1α-pvhl結合被阻斷，從而影響HIF-1α的表達[10]。

CRISPR/Cas9目前已廣泛應用于細胞基因編輯和基因調節、基因敲除動物模型的構建、人類疾病動物模型的治療研究等領域[11-12]。HEK-293細胞作為基因工程最常使用的工具細胞，在基因編輯方面已有廣泛應用。盧利莎等[13]利用CRISPR/Cas9技術成功建立了MEIS2基因完全敲除的HEK-293 T細胞株,為研究MEIS2基因的機制和功能提供了有效工具。楊芳等[14]已經成功利用CRISPR/Cas9系統構建人卵巢顆粒細胞瘤HIF-1α基因敲除細胞株。

本研究中，使用設計好的sgRNA序列與LentiCRISPR V2質粒相連，構建靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9表達載體，通過脂質體轉染將載體轉染進HEK-293細胞中，再經過嘌呤霉素篩選已編輯的細胞，在嘌呤霉素壓力下擴大培養，形成混合克隆細胞株。提取混合克隆細胞株的DNA擴增目標序列后進行T7E1酶實驗，驗證目的基因的突變情況。提取混合克隆細胞株的蛋白進行Western blotting實驗，驗證目的基因的表達情況。結果顯示，T7E1酶實驗成功將目標序列切開，說明目的基因序列成功產生突變，且設計的sgRNA敲除效率為33.8%。同時，Western blotting實驗結果顯示，敲除后的混合克隆細胞株經過氯化鈷誘導后的HIF-1α蛋白表達量較野生型細胞株有顯著降低，提示有部分細胞發生移碼突變，混合細胞株HIF-1α基因成功被敲低，靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9載體構建成功且具有相應功能。

需要說明的是，HEK-293經CRISPR/Cas9系統敲除HIF-1α基因后，出現細胞傳代數降低、生長速度減慢等現象。本研究嘗試通過有限稀釋法培育單細胞克隆，但最終細胞無法生長到需要的數量。這可能提示HIF-1α及其相關蛋白對HEK-293的生長有重要作用，目前的文獻報道成功利用CRISPR/Cas9系統構建HIF-1α敲除的細胞均為癌癥細胞[14-15]，普通細胞可能無法耐受HIF-1α敲除的影響。這可能是由于HIF與細胞衰老機制有關聯[16]，但具體原因和機制有待進一步驗證，后續實驗將嘗試將該質粒轉染進癌癥細胞并驗證猜想。

綜上所述，本研究通過在HIF-1α的3號外顯子設計特異性靶點，成功構建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9質粒，并通過T7E1酶切實驗和Western blotting實驗成功驗證其功能。這為進一步研究HIF-1α蛋白的功能奠定了基礎。