3種芩柏制劑體外經皮滲透特性及其抗銀屑病作用

曾祖平， 張 璐， 王天園， 付 京， 韓旭陽， 王 宏

(首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京市中醫藥研究所，銀屑病中醫臨床基礎研究北京市重點實驗室，北京 100010)

芩柏軟膏收載于《北京市醫療機構制劑規程》[1]，來源于皮膚外科名老中醫趙炳南先生的臨床經驗方，全方由黃芩、關黃柏組成，具有清熱解毒、利濕消腫之功效，主治熱毒瘡癤、蜂窩織炎等[2], 臨床上用于治療銀屑病、毛囊炎、皮炎、濕疹等[3-4]。為了減少皮膚刺激性，提高依從性和療效，課題組前期通過提取工藝、制劑成型工藝研究結合成熟的乳膏配方[5]，將芩柏軟膏制成凝膠、乳膏劑型[6-7]，并評價三者體外釋藥[8]。在此基礎上，本實驗進一步考察芩柏軟膏、芩柏凝膠、芩柏乳膏中黃芩苷、鹽酸小檗堿體外經皮滲透特性，以期為篩選相關制劑的適宜劑型提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司，配置G1312A二元泵、G1313A自動進樣器、G1365B多波長紫外檢測器、Agilent Chemstation色譜工作站)；RYJ-B型藥物透皮擴散實驗儀(上海黃海藥物儀器有限公司)；SK7210HP型KUDOS超聲波清洗機(上海科導超聲儀器有限公司)；超聲波細胞破碎儀(德國Bandelin公司)；全自動染色機、輪轉切片機(德國Leica公司)；XS205型電子天平(十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)；純水機(美國Millipore公司)。

1.2 試劑與藥物 芩柏凝膠(自制，批號20170828，黃芩苷含量1.20%，鹽酸小檗堿含量0.15%)；芩柏乳膏(自制，批號20170726，黃芩苷含量1.28%，鹽酸小檗堿含量0.13%)；芩柏軟膏(自制，批號20170315，黃芩苷含量1.22%，鹽酸小檗堿含量0.16%)；咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業有限責任公司，批號16110239)；戊巴比妥鈉(美國Sigma公司，批號01810754)。乙腈、磷酸為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水(自制)。

1.3 動物 BALB/c雄性小鼠，體質量20～22 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物生產許可證號SCXK(京)2014-0004。實驗經北京市中醫研究所動物倫理委員會批準。

2 方法與結果

2.1 體外經皮滲透實驗

2.1.1 正常皮膚制備 小鼠斷頸處死，背部去毛(約2 cm×2 cm)后剪下皮膚，去除皮下脂肪組織和結締組織，生理鹽水沖洗干凈，拭干表面水分，即得，立即使用。

2.1.2 模型皮膚制備 參考Van der Fits等[9]報道的方法。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(80 mg/kg)麻醉，背部去毛(約2 cm×2 cm)，單籠飼養。次日取背部光滑、無傷口的小鼠，每天背部涂抹咪喹莫特乳膏50 mg，第5天斷頸處死，剪下背部銀屑病樣皮損皮膚，去除皮下脂肪組織和結締組織，生理鹽水沖洗干凈，拭干表面水分，即得，立即使用。

2.1.3 實驗操作 采用改良的Franz擴散池[9]。將新鮮小鼠皮膚固定于擴散池上下兩部分之間，構成擴散室和接收室，表皮面向擴散室，擴散室底面積2.009 6 cm2，接收室容積6.6 mL。精密稱取芩柏軟膏、芩柏凝膠、芩柏乳膏各3份，每份0.5 g，涂滿整個表皮，在接收室中注入生理鹽水作為接收液，排出氣泡，使液面完全與真皮接觸，在恒速(150 r/min)、恒溫(37 ℃)下于1、2、4、6、8、10、12 h吸取接收液各3 mL，濾過，補加等體積的生理鹽水，測定濾液中黃芩苷、鹽酸小檗堿含量，計算累積滲透量Q，擬合體外經皮滲透方程[8]，結果見表1～2，再以Q對時間t作圖，得體外經皮滲透曲線，見圖1～2。

表1 3種芩柏制劑經小鼠正常皮膚的滲透參數(n=3)Tab.1 Permeation parameters for three Qinbai preparations through normal mouse skins(n=3)

圖1 3種芩柏制劑12 h內經小鼠正常皮膚滲透曲線Fig.1 Permeation curves for three Qinbai preparations through normal mouse skins within 12 h

注：鹽酸小檗堿僅在芩柏凝膠8、10、12 h滲透液及芩柏軟膏10、12 h滲透液中檢出，而在芩柏乳膏中未檢出，故僅繪制黃芩苷經皮滲透曲線。圖2 3種芩柏制劑12 h內經小鼠模型皮膚滲透曲線Fig.2 Permeation curves for three Qinbai preparations through model mouse skins within 12 h

表1顯示，3種芩柏制劑經小鼠正常皮膚的體外經皮滲透過程均符合零級動力學方程，黃芩苷、鹽酸小檗堿滲透速率依次為芩柏凝膠>芩柏乳膏>芩柏軟膏，兩者12 h內累積滲透量依次為芩柏凝膠>芩柏乳膏>芩柏軟膏。表2顯示，3種芩柏制劑中黃芩苷經小鼠模型皮膚的體外經皮滲透過程均符合零級動力學方程，黃芩苷12 h內累積滲透量依次為芩柏凝膠>芩柏乳膏>芩柏軟膏。另外，小鼠正常皮膚中黃芩苷、鹽酸小檗堿滲透速率、12 h累積滲透量高于小鼠模型皮膚中。

表2 3種芩柏制劑經小鼠模型皮膚的滲透參數(n=3)Tab.2 Permeation parameters for three Qinbai preparations through model mouse skins(n=3)

圖1顯示，3種芩柏制劑中黃芩苷、鹽酸小檗堿在不同時間點經小鼠正常皮膚的累積滲透量依次為芩柏凝膠>芩柏乳膏>芩柏軟膏。圖2顯示，3種芩柏制劑的黃芩苷在不同時間點經小鼠模型皮膚的累積滲透量依次為芩柏凝膠>芩柏乳膏>芩柏軟膏。

2.1.4 皮膚儲藥量測定 體外經皮滲透實驗結束后，沿擴散池邊緣剪下有效滲透面積的小鼠皮膚(約2.009 6 cm2)，用棉簽蘸取生理鹽水，將皮膚表面殘留藥物擦拭干凈，剪碎，置于玻璃勻漿管中，加入1 mL甲醇研磨5 min至勻漿狀，轉移至離心管中，9 mL甲醇分次洗滌勻漿器，洗液并入離心管中，超聲處理10 min后4 000 r/min離心10 min，吸取上清液至EP管中，氮吹至干，2 mL甲醇溶解，濾過，測定濾液中黃芩苷、鹽酸小檗堿含量，結果見表1～2。

由此可知，小鼠正常皮膚中黃芩苷、鹽酸小檗堿12 h皮膚儲藥量高于小鼠模型皮膚中；與芩柏軟膏比較，芩柏凝膠中上述2種成分在小鼠正常皮膚中的儲藥量明顯升高，并且黃芩苷在小鼠模型皮膚中的儲藥量也明顯升高。另外，黃芩苷12 h皮膚儲藥量依次為凝膠劑>乳膏劑>軟膏劑；鹽酸小檗堿12 h皮膚儲藥量在小鼠正常皮膚中依次為凝膠劑>乳膏劑>軟膏劑，在小鼠模型皮膚中依次為凝膠劑>軟膏劑>乳膏劑。

2.2 3種芩柏制劑對咪喹莫特誘導銀屑病樣小鼠模型皮損的影響

2.2.1 造模、分組與給藥 按“2.1.2”項下方法造模。小鼠去毛后，采用隨機數字表法分為空白組、模型組、丁酸氫化可的松乳膏(尤卓爾)組、芩柏凝膠組、芩柏乳膏組、芩柏軟膏組，每組8只。除空白組外，其余各組小鼠背部每天下午涂抹5%咪喹莫特乳膏約50 mg，連續5 d，每天上午9點再涂抹50 mg相應藥物，連續6 d。

2.2.2 銀屑病皮損面積和疾病嚴重程度指數(PASI)評分計算 每天上午給藥前，采用數碼照相機拍照記錄小鼠皮損情況，并依據PASI評分標準[10]計算紅斑、鱗屑、浸潤程度評分，無及輕、中、重、極重度分別計0、1、2、3、4 分，以三者評分總和為總評分。

圖3顯示，空白組小鼠皮膚光滑，無鱗屑、紅斑和浸潤現象；模型組小鼠于第2～3天開始出現輕微的背部皮膚鱗屑、紅斑、浸潤，隨造模時間延長皮損不斷加重，鱗屑多而厚，紅斑由點狀變為斑塊狀，皮膚變硬變厚浸潤明顯，提示模型建立成功；與模型組比較，3種芩柏制劑組小鼠銀屑病樣皮損癥狀有所緩解。

圖3 各組小鼠皮損Fig.3 Mouse skin lesions in various groups

圖4顯示，與模型組比較，尤卓爾組小鼠皮損PASI評分降低(P<0.05)，而3種芩柏制劑組小鼠皮損PASI評分無明顯變化(P>0.05)。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 各組小鼠皮損PASI評分Fig.4 PASI scores for mouse skin lesions in various groups

2.2.3 小鼠皮損組織形態學觀察 第6天小鼠注射過量戊巴比妥鈉后處死，剪取背部相同部位皮膚(約0.8 cm×0.8 cm)，展平，10%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE染色后在400倍光鏡下拍片，采用IPP 6.0圖像分析軟件，每個標本選取5張切片進行觀察，每張隨機測量5處從表皮角質層到基底層的垂直厚度，分析表皮層變化情況。

圖5顯示，空白組小鼠皮膚表皮層較薄；模型組小鼠表皮突延長，表皮棘細胞層明顯增厚，基底細胞核分裂像較多，并可見明顯的角化不全及角化過度，炎癥細胞浸潤嚴重；與模型組比較，3種芩柏制劑組、尤卓爾組小鼠表皮層變薄，角化不全、角化過度改善，炎癥細胞浸潤程度減輕。

表3顯示，與模型組比較，3種芩柏制劑組、尤卓爾組小鼠表皮厚度減少(P<0.01)。

表3 各組小鼠表皮厚度Tab.3 Mouse epidermal thicknesses in various

3 討論與結論

藥物體外經皮滲透特性受藥物理化性質、經皮給藥系統、皮膚生理病理的影響[11]。芩柏軟膏、芩柏凝膠、芩柏乳膏組方藥材相同，區別在于劑型及皮膚狀態，其中芩柏凝膠主要基質為水性凝膠基質，生物相容性好，延長了制劑在用藥部位的停留時間，而且其黏度小，有利于藥物釋放與滲透；芩柏軟膏基質為凡士林，屬于油脂性軟膏基質，疏水性大，釋藥性能差；芩柏乳膏基質為O/W型乳劑，理論上藥物釋放、透皮吸收速度更快，但本實驗發現該制劑中黃芩苷、鹽酸小檗堿體外經皮滲透速度和程度小于芩柏凝膠，其原因可能是藥物與乳膏基質結合緊密，不利于其釋放和滲透[5]。正常皮膚中黃芩苷、鹽酸小檗堿12 h儲藥量大于模型皮膚中，這是因為銀屑病樣小鼠皮損表皮較正常皮膚明顯增厚，角質形成細胞異常增生，而角質層為體外經皮滲透的主要屏障，從而阻礙了藥物的被動擴散。另外，鹽酸小檗堿屬季胺鹽型離子型藥物，透皮性較差，在模型皮膚滲透液中幾乎未檢出。

注：A～F分別為空白組、模型組、芩柏乳膏組、芩柏凝膠組、芩柏軟膏組、尤卓爾組。圖5 各組小鼠皮損組織形態學Fig.5 Histomorphologies for mouse skin lesions in various groups

作為芩柏制劑藥效成分，黃芩苷能改善咪喹莫誘導的小鼠銀屑病樣炎癥[12]，局部應用小檗堿油酸復合物的液晶納米儲庫水凝膠可明顯減輕銀屑病癥狀及銀屑病炎性細胞因子水平[13]。本實驗發現，3種芩柏制劑的PASI評分均不理想，推測可能與中藥在皮膚上有殘留而影響觀察有關，但不影響小鼠皮損組織形態學觀察結果。該成分透皮特性表現為芩柏凝膠滲透速率、累積滲透量、皮膚儲藥量高于芩柏乳膏、芩柏軟膏，但三者藥效無顯著差異，其原因可能為一方面在本實驗條件下量效關系不明顯，另一方面外用制劑基質對藥效有影響。

綜上所述，芩柏凝膠滲透速率、累積滲透量、不同皮膚儲藥量高于芩柏乳膏、芩柏軟膏，并且3種芩柏制劑均有抗銀屑病作用，但最終劑型還需通過臨床試驗來確定。