枸杞多糖對BaP誘導人絨毛外滋養層細胞凋亡和侵襲的影響

張翠翠， 李永川， 孫文萍

(青海紅十字醫院產科，青海 西寧 810000)

近年來，空氣污染導致的胚胎發育異常已經成為國內外研究的熱點。苯并芘(BaP)廣泛存在于空氣和水中，屬于多環芳烴類化合物，BaP是一種常見的空氣污染物，能夠引發早產、胎兒生長受限等不良妊娠[1-2]。絨毛滋養層細胞是胎盤功能發揮和胚胎成功著床的主要因素，而其過度凋亡和侵襲受阻是不良妊娠發生的關鍵[3]。枸杞多糖是枸杞的有效成分，是由酸性雜多糖、多肽、蛋白質組成的復合多糖，具有抗氧化、抗衰老、增強免疫力等功效[4]。研究表明，枸杞多糖能夠保護生殖系統，可減輕氧化損傷并促進絨毛滋養層細胞生長和分泌人絨毛膜促性腺激素[5]。目前，枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養層細胞凋亡和侵襲的影響尚不明確。本實驗以人絨毛膜滋養層細胞為體外研究對象，通過流式細胞術、Transwell小室探討枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養層細胞凋亡和侵襲能力的影響，以期為枸杞多糖在不良妊娠中的作用提供參考。

1 材料

1.1 細胞 人絨毛膜滋養層細胞購自上海弘順生物科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司；B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；膜聯蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司；苯并芘(BaP)購自無錫美贊化學品有限公司；基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體、p65抗體購自武漢友聯特生物技術有限公司；p65激活劑佛波酯(PMA)購自美國Sigma公司。枸杞多糖(純度90%)購自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞分組與處理 人絨毛膜滋養層細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養液中，培養條件為37 ℃、5% CO2。人絨毛膜滋養層細胞分為對照組、模型組及枸杞多糖低、中、高劑量組，對照組細胞不做處理；模型組細胞用含20 μmol/L BaP的細胞培養液進行培養；枸杞多糖低、中、高劑量組細胞分別用含20 μmol/L BaP和80、160、240 μg/mL枸杞多糖的細胞培養液進行培養。

2.2 流式細胞術測定細胞凋亡 培養24 h后，收集各組細胞，用PBS溶液將各組細胞密度調整為1×106/mL，吸取1 mL細胞懸浮液，1 000×g離心10 min，棄上清，在細胞中添加500 μL Binding buffer溶液，充分混合，添加PI、Annexin V-FITC染色液各5 μL，避光孵育20 min，用流式細胞儀檢測凋亡。

2.3 Transwell小室檢測細胞侵襲能力 首先將8 μm Transwell小室放入24孔板中，每孔中添加300 μL不含血清的細胞培養液，室溫孵育30 min，棄培養液，用不含血清的細胞培養液調整細胞密度為1×105/mL，在Transwell小室的下室中加入500 μL含10%胎牛血清的細胞培養液，然后在上室中加入200 μL細胞懸液，培養24 h后，用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色20 min，PBS洗滌小室3次，顯微鏡下觀察細胞穿膜數目即為細胞侵襲數目，隨機選擇5個視野，取平均值。

2.4 Western blot檢測MMP-9、Bax、Bcl-2、p65蛋白表達

培養24 h后，收集各組細胞，加入細胞裂解液，轉移到1.5 mL EP管中，置于冰上超聲粉碎，4 ℃裂解30 min，15 000×g離心10 min，吸取上清，即為細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。配制5%上層濃縮膠和10%下層分離膠，每孔蛋白上樣量為30 μg，100 V恒壓電泳，90 V轉膜90 min。將PVDF膜取出并放在5%牛血清白蛋白中，常溫孵育1 h，再依次放在一抗、二抗溶液中結合反應，ECL顯色，使用Image J軟件分析條帶灰度值，并計算目的蛋白相對表達。

2.5 p65激活劑對枸杞多糖干預BaP誘導人絨毛膜滋養層細胞的作用 細胞分為為枸杞多糖中劑量組(20 μmol/L BaP+160 μg/mL枸杞多糖)和枸杞多糖中劑量+PMA組(20 μmol/L BaP+160 μg/mL枸杞多糖+2 ng/mL p65激活劑PMA)，加藥培養24 h后收集細胞，流式細胞術檢測細胞凋亡，Transwell小室檢測細胞侵襲，Western blot檢測MMP-9、Bax、Bcl-2、p65蛋白表達。

3 結果

3.1 枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養層細胞凋亡的影響 與對照組比較，模型組細胞凋亡率升高(P<0.05)；與模型組比較，枸杞多糖各劑量組細胞凋亡率降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性，結果見圖1、表1。由此可知，枸杞多糖抑制BaP誘導人絨毛膜滋養層細胞凋亡。

圖1 各組細胞凋亡

表1 枸杞多糖對細胞凋亡的影響

3.2 枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養層細胞侵襲的影響 與對照組比較，模型組細胞侵襲數減少(P<0.05)；與模型組比較，枸杞多糖各劑量組細胞侵襲數增加(P<0.05)，并呈劑量依賴性，結果見表2。由此可知，枸杞多糖促進BaP誘導人絨毛膜滋養層細胞侵襲。

表2 枸杞多糖對細胞侵襲的影響

3.3 枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養層細胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組細胞MMP-9、Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)，Bax蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，枸杞多糖各劑量組細胞MMP-9、Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05)，Bax蛋白表達降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見圖2、表3。

圖2 各組細胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達

表3 枸杞多糖對細胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

3.4 枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養層細胞p65蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組細胞p65蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，枸杞多糖各劑量組細胞p65蛋白表達降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見圖3、表4。

圖3 各組細胞p65蛋白表達

表4 枸杞多糖對細胞p65蛋白表達的影響

3.5 PMA逆轉枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養層細胞p65蛋白表達的影響 各劑量枸杞多糖對人絨毛膜滋養層細胞均有作用，選擇中劑量初步探討其作用機制。與枸杞多糖中劑量組比較，枸杞多糖中劑量+PMA組細胞p65蛋白表達升高(P<0.05)，結果見圖4、表5。由此可知，PMA逆轉枸杞多糖對人絨毛膜滋養層細胞p65蛋白表達影響。

圖4 PMA對細胞p65蛋白表達的影響

表5 PMA逆轉枸杞多糖對細胞p65蛋白表達的影響

3.6 PMA逆轉枸杞多糖對BaP誘導人絨毛膜滋養層細胞凋亡率、侵襲數以及MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響 與枸杞多糖中劑量組比較，枸杞多糖中劑量+PMA組細胞凋亡率、細胞侵襲數及細胞中Bax、MMP-9蛋白表達均降低(P<0.05)，Bax蛋白表達升高(P<0.05)，見圖5、表6。

圖5 各組細胞凋亡(A)和MMP-9、Bcl-2、Bax蛋白表達(B)

表6 PMA對細胞凋亡率、侵襲數及MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

4 討論

環境污染是影響人類生殖系統正常功能的重要原因，其可誘發子宮內膜異位癥、月經紊亂、多囊卵巢綜合征等疾病[6]。絨毛滋養層細胞成功侵入子宮內膜是成功妊娠的基礎[7]。BaP是一個典型的多環芳烴類化合物，可誘導DNA損傷、畸形和突變[8]。BaP處理可以誘導人絨毛膜滋養層細胞過度凋亡和侵襲能力下降，所以常作為體外研究絨毛滋養層細胞損傷的誘導因子[9]。Bax和Bcl-2均屬于Bcl-2蛋白家族成員，分別在細胞凋亡過程中發揮促進和抑制作用[10]。MMP-9是細胞侵襲促進因子，其水平的高低與細胞侵襲能力正相關[11]。本實驗結果表明，BaP處理后的人絨毛膜滋養層細胞凋亡率升高，細胞侵襲能力下降，細胞中Bax蛋白表達升高，Bcl-2、MMP-9蛋白表達下降，說明BaP抑制人絨毛膜滋養層細胞侵襲并誘導細胞凋亡，提示成功構建了人絨毛膜滋養層細胞體外損傷模型。

枸杞是我國傳統中藥，具有明目、補肝腎等功效。枸杞多糖是枸杞的關鍵活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、調節免疫力、降血脂、抗輻射等作用[12-14]。研究顯示，枸杞多糖具有保護生殖系統的作用，可以降低生殖系統損傷，枸杞多糖灌胃后，實驗性高血壓妊娠小鼠胎盤明顯改善[15-17]。本實驗發現，枸杞多糖能夠降低BaP處理后的人絨毛膜滋養層細胞凋亡，促進人絨毛膜滋養層細胞侵襲，降低細胞中促凋亡蛋白Bax的表達，增加細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和促細胞轉移蛋白MMP-9的表達，提示枸杞多糖可以抑制BaP誘導人絨毛膜滋養層細胞凋亡并促進細胞侵襲。

p65是NF-κB信號激活的必需調控因子，其表達升高標志著NF-κB信號激活水平升高[18-21]。研究顯示，NF-κB參與人絨毛膜滋養層細胞損傷，在細胞損傷發生時過度激活，而下調其激活水平可以促進人絨毛膜滋養層細胞侵襲并降低細胞凋亡發生[22]。本實驗表明，枸杞多糖可以降低BaP處理后的人絨毛膜滋養層細胞中p65蛋白表達，而p65激活劑可以逆轉枸杞多糖對人絨毛膜滋養層細胞凋亡和侵襲的作用。

綜上所述，枸杞多糖可能通過降低BaP誘導人絨毛膜滋養層細胞凋亡、促進細胞侵襲而發揮保護作用，其機制可能與p65有關。目前對于枸杞多糖調控p65下游機制和體內作用還不清楚，仍需進一步探討。