黃芩苷通過調控miR-451對高糖誘導滋養層細胞損傷的保護作用

田雨青， 任宏麗*， 梁阿娟

(1.上海中醫藥大學，上海 201203；2.上海市同濟醫院，上海 200065)

妊娠期糖尿病是妊娠期發生的一種嚴重疾病，其中超重、肥胖、高齡產婦等是關鍵危險因素[1]。該病是指在妊娠期發生或首次發現的對糖耐受性降低，會出現早產、流產、巨大兒等，對母嬰健康帶來嚴重影響[2]。滋養層細胞是胚胎發育而來的，可以直接與子宮內膜的細胞接觸，在維持胚胎早期著床、母胎物質交換和排除代謝物等方面具有重要的作用，若滋養層細胞發生異常則易引起流產、早產等[3-4]。

黃芩苷是從黃芩中提取出的黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抑菌、利尿等活性[5]，可降低妊娠期大鼠模型的血壓、尿蛋白，其作用機制與sFIT-1、PLGF表達有關[6]；能抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導人早孕絨毛細胞滋養層細胞的凋亡，但在高糖環境下的研究尚不明確[7]。miRNA是非編碼RNA，廣泛參與多種疾病的發展，包括妊娠期糖尿病[8]。梁小娟等[9]報道，它在妊娠期糖尿病患者外周血中表達上調，與胰島素抵抗指數呈正相關。本實驗在高糖環境下體外培養人絨毛膜滋養層細胞，探討黃芩苷通過調控miR-451影響高糖誘導滋養層細胞的活力、凋亡和氧化應激。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo購于美國ATCC典藏中心。胎牛血清、DMEM培養基購于上海語純生物科技有限公司；葡萄糖購于美國Sigma公司；黃芩苷購于南京青澤醫藥有限公司；anti-miR-NC、anti-miR-451、miR-NC、miR-451購于上海吉瑪制藥有限公司；Lipofectamine 3000試劑盒、Trizol試劑盒購于美國Thermo Fisher公司；CCK8試劑盒、凋亡試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；cleaved-caspase3抗體、Bax抗體、GAPDH抗體購于英國Abcam公司；辣根過氧化酶標記的二抗購于武漢博士德生物工程有限公司；LDH、MDA、SOD試劑盒購于南京建成生物工程研究所；逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購于日本TaKaRa公司；引物購于廣州銳博生物技術有限公司。

1.2 細胞培養 從液氮內取出人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo，培養在含有10%胎牛血清的DMEM培養基內，置于培養箱中，在37 ℃、5% CO2下每2 d換1次培養液，當細胞生長狀態融合至80%時，加入胰酶消化培養。

1.3 分組及給藥 取對數生長狀態良好的人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo，用5.5、25 mmol/L葡萄糖處理，作為對照組和高糖組；用含25、100 μmol/L黃芩苷和25 mmol/L葡萄糖處理細胞，作為高糖+黃芩苷低、高劑量組；將anti-miR-NC和anti-miR-451轉染人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo后進行高糖處理，作為高糖+anti-miR-NC組、高糖+anti-miR-451組；將miR-NC和miR-451轉染人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo后，采用25 mmol/L葡萄糖和100 μmol/L黃芩苷處理細胞，作為高糖+黃芩苷+miR-NC組、高糖+黃芩苷+miR-451組。參照Lipofectamine 3000試劑盒說明書進行細胞轉染，48 h后收集細胞，進行后續實驗。

1.4 CCK8檢測細胞活性 取人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo，重懸后接種在96孔細胞板中，培養48 h后每孔加入10 μL CCK8溶液，室溫下反應2 h，在450 nm波長處檢測吸光度，計算細胞活性。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 取人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo，接種在6孔細胞板中，離心后除去上清，加入400 μL結合緩沖液吹打后加入Annexin V-FITC、PI各5 μL，避光反應15 min，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

1.6 Western blot檢測cleaved-caspase3、Bax蛋白表達 取人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo，加RIPA蛋白裂解液提取總蛋白并檢測濃度，100 ℃煮沸變性5 min，取40 μg在SDS-PAGE上進行電泳分離處理，轉膜，加入脫脂奶粉封閉培養2 h，加入cleaved-caspase3、Bax、GAPDH抗體，在4 ℃下過夜培養，洗膜3次，加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫培養2 h，洗膜3次，加入ECL發光液，顯影，以GAPDH為內參，采用Image J軟件掃描分析蛋白條帶的灰度值。

1.7 試劑盒檢測MDA水平及LDH、SOD活性 取人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo，清洗后加入裂解液，離心取細胞上清液，參照相關試劑盒說明書分別檢測MDA水平及LDH、SOD活性。

1.8 RT-qPCR檢測miR-451表達 取人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo，加入Trizol試劑進行總RNA提取，采用分光度計檢測260、280 nm波長處RNA濃度，參照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，將cDNA滅活后參照熒光定量試劑說明進行PCR擴增，以U6為內參，采用2-ΔΔCT法檢測miR-451表達。miR-451正向引物序列5′-AAACCGTTACCATTACTGAGTT-3′，反向引物序列5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；U6正向引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物序列5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

2 結果

2.1 不同濃度黃芩苷對高糖誘導滋養層細胞活性和凋亡的影響 與對照組比較，高糖組細胞活性降低(P<0.05)，細胞凋亡率、cleaved-caspase3和Bax蛋白表達升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+黃芩苷低、高劑量組細胞活性升高(P<0.05)，細胞凋亡率、cleaved-caspase3和Bax蛋白表達降低(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 各組細胞凋亡率(A)、凋亡相關蛋白(B)(Ⅰ)

表1 不同濃度黃芩苷對高糖誘導滋養層細胞活性和凋亡的影響

2.2 不同濃度黃芩苷對高糖誘導滋養層細胞氧化應激的影響 與對照組比較，高糖組細胞LDH活性、MDA水平升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+黃芩苷低、高劑量組細胞LDH活性、MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度黃芩苷對高糖誘導滋養層細胞氧化應激的影響

2.3 不同濃度黃芩苷對高糖誘導滋養層細胞miR-451表達的影響 與對照組比較，高糖組細胞miR-451表達升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+黃芩苷低、高劑量組細胞miR-451表達降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組細胞miR-451表達比較

2.4 干擾miR-451對高糖誘導滋養層細胞活性和凋亡的影響 與高糖+anti-miR-NC組比較，高糖+anti-miR-451組細胞miR-451表達、細胞凋亡率及cleaved-caspase3、Bax蛋白表達降低(P<0.05)，細胞活性升高(P<0.05)，見圖2、表4。

表4 干擾miR-451對高糖誘導滋養層細胞活性和凋亡的影響

圖2 各組細胞凋亡率(A)、凋亡相關蛋白(B)(Ⅱ)

2.5 干擾miR-451對高糖誘導滋養層細胞氧化應激的影響 與高糖+anti-miR-NC組比較，高糖+anti-miR-451組細胞LDH活性、MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，見表5。

表5 干擾miR-451對高糖誘導滋養層細胞氧化應激的影響

2.6 黃芩苷對高糖誘導滋養層細胞活性、凋亡、氧化應激的影響 與高糖+黃芩苷+miR-NC組比較，高糖+黃芩苷+miR-451組細胞miR-451表達、細胞凋亡率、LDH活性、MDA水平及cleaved-caspase3、Bax蛋白表達升高(P<0.05)，細胞活性、SOD活性降低(P<0.05)，見圖3、表6。

圖3 各組細胞凋亡率(A)、凋亡相關蛋白(B)(Ⅲ)

表6 黃芩苷對高糖誘導滋養層細胞活性、凋亡、氧化應激的影響

3 討論

糖代謝異常是妊娠期糖尿病發生的主要原因，高糖能夠使滋養層細胞、心肌細胞等發生凋亡，抑制細胞的增殖[10]。高糖處理滋養層細胞，能夠使滋養層細胞的微絨毛排列紊亂和出現破壞、疏密不均等現象[11]，促進滋養層細胞的凋亡、氧化應激和炎癥反應[12-13]。本研究中用25 mmol/L葡萄糖處理人絨毛膜滋養層細胞，抑制細胞的活力，促進細胞的凋亡率，上調cleaved-caspase3和Bax蛋白表達，LDH活性、MDA水平升高，SOD活性降低。黃芩具有瀉火排毒、止血和安胎等功效，黃芩苷是從黃芩內提取分離的黃酮類化合物，在抗炎、抗氧化、降血壓等多種藥理活性[14]。人早孕絨毛滋養層細胞經過TNF-α處理后，黃芩苷促進滋養層細胞細胞的增殖，效果優于黃芩水提取物[15]。黃芩苷能夠抑制TNF-α誘導的人蛻膜細胞的凋亡，促進細胞增殖[16]。本研究選取25、100 μmol/L黃芩苷作用人絨毛膜滋養層細胞后，促進高糖誘導的細胞活性，抑制細胞凋亡率，下調cleaved-caspase3和Bax蛋白表達，LDH活性、MDA水平降低，SOD活性升高，說明黃芩苷能夠減緩高糖誘導的人絨毛膜滋養層細胞的凋亡和氧化應激，促進細胞的活力。

miRNA是一種高度保守的單鏈非編碼RNA分子，通過調控下游mRNA，參與滋養層細胞的增殖、凋亡等多種生物學作用[17]。Zhou等[18]研究顯示，miR-384在胚胎和血漿、滋養細胞HTR-8/SVneo中表達上調，miR-384通過靶向負調控PTBP3能夠抑制滋養細胞HTR-8/SVneo的增殖。曹文超等[19]研究顯示，過表達miR-205-5p在滋養層細胞HTR-8/Svneo中表達上調，過表達miR-205-5p可以抑制滋養層細胞HTR-8/Svneo的增殖和侵襲，促進細胞的凋亡。本研究顯示，高糖處理人絨毛膜滋養層細胞后，miR-451表達上調，經過25、100 μmol/L黃芩苷處理后，miR-451表達下調，干擾miR-451能夠促進高糖誘導的人絨毛膜滋養層細胞的活力，抑制細胞凋亡和氧化應激。過表達的miR-451部分恢復，說明黃芩苷可能通過調控miR-451減緩高糖誘導的人絨毛膜滋養層細胞氧化損傷。

綜上所述，高糖條件下miR-451表達上調，黃芩苷能夠通過下調miR-451的表達減緩高糖誘導的人絨毛膜滋養層細胞的凋亡和氧化應激，促進細胞的活力，起到保護細胞的作用。