銀藍調脂膠囊調節脂質代謝物質基礎的篩選

鄭柳怡， 黃丹娥， 許華珍， 陳玉興*

(1.廣州中醫藥大學第五臨床醫學院，廣東 廣州 510275；2.廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東省中醫藥研究開發重點實驗室, 廣東 廣州 510095)

計算機輔助藥物設計(Computer-aided drug design，CADD)指基于分子模擬的分子設計技術[1]，根據靶點結構性質選擇合適的方法對中藥化合物進行篩選，得到潛在活性成分。作為計算機技術、分子藥理學和分子生物學等多學科交叉發展的基礎上形成的藥物研發新技術，該技術在先導化合物發現和優化中有重要作用，可大大減少新藥創制的盲目性和偶然性[2]，已廣泛運用于中藥及其復方藥效的物質基礎和分子機制的研究。

高脂血癥(Hyperlipidemia，HLP)是由脂質代謝紊亂引起的某一種或多種血脂水平升高的病癥[3]，嚴重危害人類健康，已成為多種心血管疾病發生的高危因素[4]，臨床上以總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)升高作為確診標準[5]。HMG-COA、SQS是TC合成過程的2種酶，抑制兩者表達可有效抑制TC合成[6]；PPARα是TG合成的重要調控因子，可通過激動PPARα靶標有效抑制TG合成[7]。

銀藍調脂膠囊由銀杏葉、絞股藍、化橘紅、酒制蜂膠組成，能降低小鼠、大鼠、新西蘭兔等多種實驗性高脂血癥動物模型血清中TC、TG水平[8-10]，但其有效成分及作用靶點尚未清楚。因此，本研究將采用CADD技術，通過分子對接、相似度檢索從銀藍調脂膠囊中篩選有效降脂成分，旨在從分子水平闡釋該制劑治療高脂血癥作用的藥效物質基礎，為其治療高脂血癥的臨床應用及藥物開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 銀藍調脂膠囊成分化學結構數據庫建立 以“銀杏葉”“絞股藍”“化橘紅”“蜂膠”為關鍵詞，在Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform(TCMSP) 數據庫中搜索得到403個天然小分子的化學結構，其中銀杏葉110個，蜂膠139個，絞股藍104個，化橘紅81個。采用ChemBioDraw繪圖軟件繪制結構式，并將結構式、藥材來源、分子量等信息保存于ISISDatabase數據庫中。

1.2 靶蛋白選擇及可靠性認證 選擇HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶蛋白晶體結構作為靶標，建立活性小分子化合物查詢庫，以銀藍調脂膠囊化合物庫為檢索庫(403個化合物)進行檢索，設定相似度閾值為70%。采用gacf_vs相似度檢索軟件，計算檢索庫和查詢庫中化合物相似度，相似度越高，靶標可靠性越強。

1.3 銀藍調脂膠囊與HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶作用靶標結合模式分析 選擇HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶蛋白晶體作為虛擬篩選靶點結構，從Protein Data Bank(PDB) 數據庫中獲取分辨率<3 ?(1 ?=1×10-10m)，并且含有活性小分子配體的靶標晶體結構HMG-COA 13個(PDB代碼1HW9、1HWJ、1HWK、1HWL、2Q1L、2Q6C、2R4F、3BGL、3CCT、3CCZ、3CD0, 3CD7, 3CDA)，PPARα 11個(PDB代碼1I7G、1KKQ、2P54、2REW、2ZNN、3ET1、3FEI、3G8I、3KDT、3R5M、3VI8)，角鯊烯合成酶7個(1EZF、3ASX、3LEE、3Q2Z、3Q30、3V66、3VJC)。通過將靶標所有的蛋白質晶體結構導入MOE中，設定參數將蛋白質進行疊合，使蛋白質按照同樣的骨架和氨基酸進行疊合，小分子配體會隨著蛋白質骨架的疊合而疊合在同一位置。采用MOE The Protein Ligand Interaction Fingerprints(PLIF)受體-配體相互作用指紋圖譜分析程序，分別對HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶靶標進行結合模式分析，即按照指紋圖譜運算程序設定參數，得到所有晶體結構及其配體的結合模式指紋圖譜。

1.4 對接軟件認證 不同蛋白質晶體結構因其所處環境(如水、離子、小分子配體等)的差異，導致整個蛋白質晶體體系不同，加之不同軟件算法差異，更使得軟件對蛋白體系的適應性有所差別，故在進行分子對接前，應先考慮對接軟件對目標蛋白體系的適應性。本研究使用Cdocker程序對HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶靶標系統適用性進行考察。

1.5 分子對接計算及結果分析 將HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶晶體結構文件3CDA分別導入對接軟件，加CHARMM力場，定義受體和結合位點，選用Cdocker程序對接，參數設置為默認值。以銀藍化合物“-Cdocker_energy”及與靶標結合情況(以晶體靶標蛋白的結合模式為標準，化合物與靶標結合應跟結合模式熱點殘基氨基酸全部或部分結合)為標準選出潛在活性化合物，將其與靶標相似度進行綜合評價，采用consensus score(CSi)方法計算同時滿足對接篩選條件和相似度>70%的化合物的CSi值，其數值越大，表明化合物活性越強，公式為CSi=Xi×Yi，Xi=[xi-min(x)]/[max(x)-min(x)]，其中X是化合物與靶標對接得到的標準對接值，xi是該化合物與靶標蛋白對接得到的歸一化數值，Yi是該化合物與已知晶體靶標活性化合物相似度。

2 結果

2.1 銀藍調脂膠囊作用靶標及其可靠性 將HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶靶標納入相似度搜索，采用相似度軟件計算銀藍調脂膠囊化合物庫與上述靶標活性小分子化合物的相似性，結果以>70%相似度化合物數、平均相似度、命中比例為評判標準，大于70%化合物的數量越多，靶標越可靠。結果，銀藍調脂膠囊化合物與已知活性化合物的相似度均大于70%，見表1。

表1 銀藍調脂膠囊化學成分與靶標活性小分子化合物的相似度

2.2 晶體靶標結合模式 結合模式指紋圖譜體現的是該蛋白與活性小分子配體結合的氨基酸的種類和個數及出現的頻數，出現頻數高的氨基酸即為熱點殘基。熱點殘基可作為判斷虛擬篩選化合物潛在活性的標準，若虛擬篩選的化合物與熱點殘基有結合，表明該化合物具有潛在的活性。因此，指紋圖譜結合氨基酸是后續虛擬篩選結果評判的標準之一。

2.2.1 HMG-COA 通過PLIF軟件對HMG-COA的13個晶體結構進行計算分析，結合模式指紋圖譜(圖1)，有10個氨基酸與HMG-COA靶標晶體結合，其中Arg590、Ser654、Asp690、Lys691、Lys692、GluB559、LysB735、AsnB755氨基酸結合率為100%，即所有晶體都與它們相結合，SerB565出現頻率為76.92%，Cys561出現頻率為23.08%。因此，Arg590、Ser654、Asp690、Lys691、Lys692、GluB559、LysB735、AsnB755是虛擬篩選化合物結合氨基酸參考標準。

圖1 HMG-COA結合模式指紋圖譜

2.2.2 PPARα 通過PLIF軟件對PPARα的11個晶體結構進行計算分析，結合模式指紋圖譜(圖2)，結合頻率最高的氨基酸為Cys276、Ser280、Yyr314、His440、Tyr464, 結合率為90.9%；其次是Cys275、Val332，結合率為72.73；Thr279為36.36%；Leu321為27.27%；結合1次的是Glu268、Phe273、Val306、Gly313、Ile354、Met355、Leu436、Val444。因此，Cys276、Ser280、Yyr314、His440、Tyr464、Thr279、 Leu321是虛擬篩選化合物結合氨基酸參考的標準。

圖2 PPARα結合模式指紋圖譜

2.2.3 角鯊烯合成酶 通過PLIF軟件對角鯊烯合成酶的7個晶體結構進行計算分析，結合模式指紋圖譜(圖3)，其中結合率最高的氨基酸是Tyr73，為85.7%；其次是Phe54、Leu211，為71.43%；Arg77為42.86%；Arg52、Sre53、Asp80、Gln212、Asn215結合頻數為2次；Thr50、Ser51、Lys117、Try171、Arg218結合頻數為1次。因此，Tyr73、Phe54、Leu211、Arg77為熱點殘基氨基酸。

圖3 角鯊烯合成酶結合模式指紋圖譜

2.3 分子對接軟件適用性 將晶體結構自身配體對接到原空間位置上，選取10個最優構象，將其與晶體結構原來構象進行比較，要求RMSD值<1或在1個固定值范圍內波動，用于HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶對接的晶體PDB代碼分別為3CDA、3VI8、3V66，發現三者自身配體對接產生的10個構象與原來配體的構象疊合，對接前后構象變化不大，符合對接軟件適用性要求，見表2、圖4。因此，選擇Cdocker對接軟件對這3個靶標進行虛擬篩選。

表2 3CDA、3VI8、3Q30自身配體對接RMSD結果

注：棍棒模型表示的化合物為配體原本的構象，線性模型表示的是對接后產生的構象。圖4 3CDA、3VI8、3Q30自身配體的化學結構及對接構象疊合

2.4 分子對接

2.4.1 作用于HMG-CoA靶標 使用Cdocker軟件對接并計算得到CSi值，結合相似度大于70%篩選出13個潛在的活性化合物，均來源于蜂膠，表明該藥材通過抑制HMG-COA靶點來抑制膽固醇合成，從而降低膽固醇水平，見表3、圖5。

表3 潛在HMG-COA抑制活性CSi值(1 kcal/mol=4.18 kJ/mol)

圖5 HMG-COA靶標潛在活性化合物分子結構式

2.4.2 作用于PPARα靶標 根據CSi值，結合相似度大于70%篩選出26個潛在的活性化合物，來源于蜂膠、化橘紅，表明這2種藥材通過激活PPARα靶標來促進脂肪酸的分解代謝并降低體內甘油三酯水平，見表4、圖6。

表4 潛在PPARα激動活性CSi值(1 kcal/mol=4.18 kJ/mol)

圖6 PPARα靶標潛在活性化合物

2.4.3 作用于角鯊烯合成酶靶標 使用Cdocker軟件對接并計算得到CSi值，結合相似度大于70%篩選出19個潛在的活性化合物，來源于蜂膠、絞股藍、銀杏葉、化橘紅，表明銀藍調脂膠囊可通過抑制角鯊烯合成酶靶標，使膽固醇合成通路受到抑制，從而降低體內膽固醇水平，見表5、圖7。

圖7 角鯊烯合成酶靶標潛在活性化合物

表5 潛在角鯊烯合成酶抑制活性CSi值(1 kcal/mol=4.18 kJ/mol)

3 討論

高脂血癥是以血液中甘油三酯以及總膽固醇異常升高為主要特征的引起脂質水平紊亂的代謝性疾病[11]。在脂質代謝中，PPARα是關鍵轉錄因子之一，促進脂肪酸合成途徑相關酶的表達，加速脂肪酸的分解代謝，降低體內甘油三酯的水平[12]。HMG-COA還原酶是體內生物合成膽固醇過程中的限速酶，體內膽固醇水平的升高與該蛋白的過度表達密切相關[13]。SQS是膽固醇合成途徑中的關鍵酶，抑制SQS可以有效降低TC、TG水平[14]。前期研究發現銀藍調脂膠囊降低高脂血癥新西蘭兔以及高血脂癥大鼠血清TC、TG水平[8-10]。

本研究采用計算機輔助藥物設計技術，使用gacf_vs相似度檢索軟件以及Cdocker程序對銀藍調脂膠囊化合物與HMG-COA、PPARα以及SQS靶標蛋白的相互作用進行了對接計算研究，發現蜂膠作用于HMG-COA、PPARα以及SQS靶點，具有多靶點效應。銀藍調脂膠囊發揮調節膽固醇合成與代謝作用的主要藥物為蜂膠。化橘紅作用于PPARα，發揮促進脂肪酸代謝以降低體內甘油三酯水平的作用，而銀杏葉與絞股藍作用于SQS靶標，抑制膽固醇的合成。人參皂苷Rb1具有促進細胞增殖、降脂等多種藥理活性，絞股藍皂苷A具有抗炎、防治動脈粥樣硬化的作用[15-16]。本研究發現，單個化合物能作用于多個靶標，如山柰酚之于HMG和PPARα靶標，再選擇HMG-COA、PPARα以及SQS靶標，采用計算機輔助藥物設計聯合靶點反向預測的研究方法，初步闡明了銀藍調脂膠囊調節高脂血癥的物質基礎及分子機制。