基于網絡藥理學探討連花清瘟顆粒治療COVID-19的物質基礎

王 玉， 靳曉杰#， 趙 磊， 夏鵬飛， 羅 宏， 李潮新， 石生青， 劉秀珠，張志明， 劉永琦,6*

(1.甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.西北中藏藥協同創新中心，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅中醫藥大學，甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；5.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000；6.甘肅中醫藥大學敦煌醫學與轉化教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

自新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染所致的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)爆發以來[1]，已波及全球204個國家和地區，COVID-19具有潛伏期長、傳染性強、各類人群普遍易感且臨床表現多樣等特點，嚴重者可快速發展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、出凝血功能障礙、腎衰竭，甚至死亡[2]。SARS-CoV-2是一種新發現的β屬冠狀病毒，目前對這種病毒的認識較初淺，且COVID-19的臨床治療主要是對癥治療，尚無特效藥物，因此迫切需要尋找并開發新的治療方法和藥物[3]。COVID-19屬于中醫疫病范疇，病因為感受疫戾之氣，病位在肺，病機特點為“濕、熱、毒、瘀”，中醫辨證論治方案多以開肺化痰、解毒活血類中成藥為主，其中連花清瘟顆粒為治療乏力伴發熱者的代表性藥物。

連花清瘟顆粒由連翹、金銀花、麻黃、苦杏仁、石膏、板藍根、綿馬貫眾、魚腥草、藿香、大黃、紅景天、薄荷腦、甘草13味藥材組成，針對COVID-19“疫毒外侵，熱毒襲肺”的病機特點，連花清瘟顆粒能夠發揮其宣肅肺氣、清化痰熱、解毒活血的功效，緩解COVID-19患者初期的發熱、呼吸道癥狀，同時達到衛氣同治、表里雙解、整體調節的治療效果，有助于阻斷患者較快進入“炎癥風暴”。

分子對接技術是指利用計算機輔助模擬將配體與受體蛋白結合，通過化學計量學方法模擬兩者的低能結合過程[4]；系統生物學是通過數據庫檢索、高通量組學數據分析和計算機模擬等多種技術構建多層次、多結構、多維度網絡，實現從系統水平研究藥物多靶標、多成分、多途徑的作用規律[5]，在中藥復方活性成分和機制研究中得到了充分的應用[6]。研究證實SARS-CoV-2通過血管緊張素換酶2(ACE2)感染人體細胞[7-8]，提示靶向阻斷SARS-CoV-2 S蛋白可作為抗COVID-19藥物設計的關鍵靶標。本研究采用分子對接、聚類分析及靶向篩選的系統研究方法，對連花清瘟顆粒系統調節、SARS-CoV-2 S靶向阻斷治療COVID-19的物質基礎及作用機制進行了不同層次的探索，以期為抗COVID-19藥物研發和指導臨床用藥提供理論參考。

1 方法

1.1 化合物信息收集 借助TCMSP(http://tcmspw.com/index.php)、TCMID(http://119.3.41.228：8000/tcmid/)數據庫等平臺，以連花清瘟顆粒所含13味中藥為關鍵詞，整理分析其化合物。檢索ETCM(http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/index.php/Home/Index/)數據庫和查詢文獻收集所含中藥的歸經，并構建“藥材-歸經”網絡模型。

1.2 成分-SARS-CoV-2 S分子對接 本研究選擇S晶體結構作為分子對接的晶體結構，將連花清瘟顆粒所含化合物與SARS-CoV-2 S空間形狀的匹配情況采用Schroding 9.4.5軟件的Glide模塊進行分子對接，根據系統能量的大小進行打分并通過Lipinski規則(分子量小于500，氫鍵給體數目小于5，氫鍵受體數目小于10，脂水分配系數小于5，可旋轉鍵的數量不超過10)篩選其關鍵性成分，并分析關鍵成分和SARS-CoV-2 S靶蛋白的結合模式。

1.3 活性成分篩選、靶點預測及層次聚類分析 對連花清瘟顆粒中連翹、金銀花、麻黃、苦杏仁、板藍根、綿馬貫眾、魚腥草、藿香、大黃、薄荷腦所含化合物中符合口服生物利用度(OB)≥30%(甘草OB≥40%)、類藥性(DL)≥0.18者作為活性成分，而紅景天借助TCMID數據庫及類藥五原則篩選得到者作為活性成分。通過基于分子相似性原理預測小分子化合物的作用靶點數據庫SwissTarget(http://www.swisstargetprediction.ch/)檢索概率值(Probablity)≥0.5的大分子作為活性成分的潛在相關靶標蛋白。將符合篩選條件的活性成分及其對應的作用靶點數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“藥材-活性成分-作用靶點”網絡模型，通過模型中度值(degree)大于其平均值的指標作進一步篩選，并采用化學信息學軟件包canvas計算化學小分子化合物分子指紋，然后通過基于相似性矩陣的層次聚類方法對重要化合物結構屬性進行聚類，類間距離選擇簇間平均距離法。

1.4 靶蛋白互作網絡構建 通過STRING平臺(https://string-db.org/)，導入篩選后主要靶蛋白，將蛋白質種類設置為“Homosapiens”，作用閾值設置為“medium confidence≥0.7”，其他條件保持默認設置進行操作，并構建蛋白互作(PPI)網絡模型。采用Cytoscapec 3.7.2插件中的MCODE模塊進一步對PPI進行模塊的劃分與分析，網絡中蛋白質節點連接度的臨界值大于3。

1.5 靶點通路分析 將篩選得到活性成分作用靶點導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)，分析潛在靶標蛋白基因的功能及其在信號通路中的作用，通過輸入靶基因名稱列表并限定物種為人源(Homosapiens)，將所有靶基因名稱校正為其官方名稱(official gene symbol)。經上述數據庫檢索和轉化操作，設定閾值P<0.05，進行GO生物學過程富集分析、KEGG信號通路富集分析，選取前20個條目，采用Prism軟件和在線繪圖站Omishare(http://www.omicshare.com/tools/index.php/)將其進行可視化處理。

2 結果

2.1 化合物與SARS-CoV-2 S蛋白分子對接 連花清瘟顆粒中連翹、金銀花、麻黃、苦杏仁、石膏、板藍根、綿馬貫眾、魚腥草、藿香、大黃、紅景天、薄荷腦、甘草所含化合物共1 769個，其中大黃92個，板藍根169個，連翹50個，金銀花236個，麻黃363個，苦杏仁113個，貫眾31個，魚腥草50個，廣藿香94個，薄荷164個，甘草280個，紅景天27個，將它們與SARS-CoV-2 S的分子進行對接，根據空間形狀匹配程度進行打分，篩選對接打分絕對值大于5 kcal/mol的小分子化合物共69個，通過Lipinski規則對以上結果進行篩選后得到7個，分別為芹菜素、桔皮素、刺槐素、去甲麻黃堿、大黃素甲醚、血清素、甘草查耳酮，其中芹菜素為薄荷、藿香、麻黃、金銀花共有成分，桔皮素、甘草查耳酮為甘草所含成分，大黃素甲醚、血清素為大黃所含成分，刺槐素、去甲麻黃堿分別為薄荷、麻黃所含成分，見表1。

表1 連花清瘟顆粒中7個核心化合物

2.2 藥材-歸經網絡 網絡中連接度最大的2個節點是肺(lung)、胃(stomach)，度值(degree)分別是10、7，表明連花清瘟顆粒中大多數藥材歸于上述2經，見圖1。

注：圓形代表歸經，三角形代表中藥。圖1 連花清瘟顆粒藥材-歸經網絡圖

2.3 活性成分篩選、靶點預測及蛋白互作分析 以OB≥30%、DL≥0.18為標準篩選出的活性成分共244種，其中大黃16種，板藍根39種，連翹、金銀花、麻黃各23種，苦杏仁19種，貫眾、魚腥草各7種，藿香11種，薄荷10種，甘草以OB≥40%、DL≥0.18為標準篩選出69種活性成分，紅景天經類藥五原則篩選到20種活性成分；作用靶點1 362個，其中概率值(probability)≥0.5者149個，互作值(interaction score)≥0.7者145個。STRING數據庫對靶點蛋白進行互作分析，結果見圖2，網絡共145個節點，346條邊，平均連接度是4.77，各節點表示作用靶點，每條邊表示各作用靶點之間的相互關系，顏色越深、節點越大表示該節點對應的作用靶點越重要。對PPI網絡進行拓撲分析，得到該網絡樞紐蛋白(圖3)，其中PIK3R1、APP、AKT1、EGFR、SRC、AR等靶點的度值顯著高于其他靶點，提示可能是連花清瘟顆粒治療COVID-19的關鍵作用靶點。

圖2 連花清瘟顆粒活性成分作用靶點互作網絡圖

圖3 蛋白互作網絡中識別的主要功能模塊

2.4 藥材-化合物-靶點相互作用網絡 藥材-化合物-靶點網絡共有341個節點，包括12種藥材節點、184個化合物節點、145個作用靶點節點，見圖4，充分體現了連花清瘟顆粒多成分與多靶點共同作用的整體性、關聯性特點。通過分析化合物-靶點的度值(degree)發現，大于平均值的關鍵性成分有51種，并進行結構層次聚類分析，結果見圖5，可知主要包括黃酮、黃酮苷、甾醇、蒽醌等8類，其中黃酮類30種，占比58.8%，排名前5位的為MOL000098-槲皮素、MOL00422-山柰酚、MOL000006-木犀草素、MOL002823-草棉黃素、MOL000354-異鼠李素，分別與105、101、99、98、98個靶點蛋白發生作用，可能為連花清瘟顆粒核心成分。

圖4 連花清瘟顆粒藥材-化合物-靶點網絡圖

圖5 連花清瘟顆粒中關鍵成分的聚類分析

前期報道，槲皮素、山柰酚、木犀草素與COVID-19緊密相關的靶點3CLpro和ACE2有較好的空間結合能力[9-10]；國外有研究認為，黃酮類化合物(如槲皮素、異鼠李素等)對干擾素TH-1和TH-2的調節作用有利于加強正常細胞的抗病毒能力[11]。從靶點的角度分析，排名前5位的關鍵靶點分別是HARS、AKT1、PIK3R1、ESR2、ADORA2A等，其中HARS、PIK3R1、AKT1等靶點均參與了非小細胞肺癌、T細胞受體信號通路及小細胞肺癌過程；ADORA2A具有負向調節免疫反應功能，不僅能抑制T細胞功能，還可促進調節性T細胞的發育從而保護宿主免受過度的組織破壞。因此，連花清瘟顆粒阻斷SARS-CoV-2感染人肺部、延緩全身重要組織器官功能受損的可能作用機制為槲皮素、山柰酚、木犀草素、草棉黃素、異鼠李素等活性成分作用于HARS、AKT1、PIK3R1、ESR2及ADORA2A等靶點所致。

2.5 關鍵靶點通路分析 GO功能富集、KEGG通路富集分析結果見圖6，共得到GO條目554個(P<0.01)，其中生物過程(biological process，BP)條目449個，細胞組成(cell composition，CC)條目38個，分子功能(molecular function，MF)條目67個，分別占81%、2%、12%。KEGG通路富集分析篩選得到33條(P<0.05)信號通路，其中與肺炎相關的通路包括非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)、小細胞肺癌(small cell lung cancer)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)、B細胞受體通路(B cell receptor signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)；與肺損傷保護相關的通路包括MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、mTOR信號通路(mTOR signaling pathway)、VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、鈣信號通路(calcium signaling pathway)、神經營養素信號通路(neurotrophin signaling pathway)、Fc-epsilon-RI信號通路(Fc epsilon RI signaling pathway)、ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)、胰島素信號通路(insulin signaling pathway)、類固醇激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)等；與癌癥相關的通路是癌癥通路(pathways in cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、結腸癌(colorectal cancer)等，其中非小細胞肺癌、小細胞肺癌、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、MAPK信號通路主要與肺炎相關[12]。

圖6 GO功能(A)、KEGG富集(B)分析圖

2.6 分子對接研究 以對接分數絕對值大于5 kcal/mol為條件，發現符合Lipinski規則的關鍵成分主要為芹菜素(藿香、麻黃、金銀花)、桔皮素(甘草)、刺槐素(薄荷)、去甲麻黃堿(麻黃)、甘草查耳酮(甘草)、大黃素甲醚(大黃)、血清素(大黃)7種成分，包括4種黃酮類、1種生物堿、1種蒽醌，見圖7，可知連花清瘟顆粒防治COVID-19主要以黃酮類或水解為黃酮類成分而發揮作用。與SARS-CoV-2 S蛋白結合分值較高的化合物具有相同的母核結構，其空間結合模式具有一定的相似性，其中A環上的羥基與氨基酸殘基Glu 484、Gly 485、Phe 490形成氫鍵，Tyr 489與A環形成π-π堆積作用，周圍的疏水性殘基進一步穩定了化合物與蛋白的結合；芹菜素C環上的羰基亦與殘基Phe 490形成氫鍵，刺槐素的B環與殘基Phe 456形成π-π堆積作用，這些相互作用力確定了三維空間中化合物在結合區域中的位置，使得結合會更加穩定。因此，基于相互作用模式推測，連花清瘟顆粒中阻斷SARS-CoV-2 S蛋白的化合物主要為具有黃酮骨架結構的化合物，與靶點關鍵殘基形成氫鍵、π-π堆積和疏水作用。

圖7 分子對接模式圖

3 討論

連花清瘟顆粒(膠囊)是2003年“非典”時期由中國軍事醫學科學院針對抗新型冠狀病毒SARS開發的，抑制SARS-CoV病毒的半數有效濃度(IC50)為0.09 mg/mL，其治療指數為40.33，可明顯抑制SARS病毒的復制，也是為數不多有證據表明具有抗SARS-CoV作用的中藥之一[13]。Walls等[14]研究發現SARS-CoV-2 S蛋白的結構域B與人ACE2具有較高的結合親和力，揭示了SARS-CoV-2在人類中的傳染性，提示SARS-CoV-2 S蛋白可能為抗COVID-19的有效靶點。因此，通過將連花清瘟中所含成分與其進行分子對接、靶點預測及層次聚類分析發現，連花清瘟顆粒中13味藥材的51種關鍵成分中黃酮類成分所占比最高(58.8%)，并且化合物-靶點網絡中以中心度值、親中心度值及度值篩選得到排名前10位的化合物如槲皮素、山柰酚、木犀草素、草棉黃素、異鼠李素、草質素、金圣草(黃)素等，也均為黃酮類成分，提示連花清瘟顆粒可能通過黃酮或黃酮苷的形式作用于SARS-CoV-2 S靶點蛋白而產生抗COVID-19的作用。研究表明槲皮素既有抗感染活性，又有抗復制活性，在單層細胞培養中槲皮素可抑制多種病毒對細胞的感染，并且可以抑制病毒在細胞內復制[15]。李海波等[16]實驗研究表明黃酮類成分異鼠李素、槲皮素及木犀草素在體外具有較強的抗甲型流感病毒的活性。本研究僅對連花清瘟顆粒中靶向SARS-CoV-2感染受體細胞的配體蛋白S蛋白進行了分子對接研究，未對其他的非質控指標的化合物進行分析；并且由于對病毒、疾病并發癥、后遺癥的認識不足和網絡藥理學與分子對接技術本身存在的局限性，在后期實驗研究中應加以驗證。

根據中醫理論分析，COVID-19感染的病位在肺，病因屬性為“濕毒疫”，濕困脾閉肺，使氣機升降失司[17]。由“中藥-歸經”網絡模型可知，連花清瘟顆粒中13種藥材有10種歸肺經，表明連花清瘟顆粒對肺部病變具有特異的治療作用。此外，該方中多味藥物歸脾、胃經，表明連花清瘟顆粒還可改善脾胃升降失常所致的“濕邪”。KEGG分析得到的連花清瘟顆粒抗COVID-19的多條信號通路中，與肺部最為相關的3條通路——非小細胞肺癌、T細胞受體信號通路、小細胞肺癌均包括HARS、PIK3R1和AKT1等靶點，且這些靶點是連花清瘟顆粒所含關鍵成分的作用靶點。此外，連花清瘟顆粒抗COVID-19的信號通路還涉及B細胞受體信號通路、免疫通路Toll樣受體信號通路、VEGF信號通路、MAPK樣受體信號通路等與肺損傷保護相關的通路及前列腺癌、胰腺癌及甲狀腺癌等癌癥通路，涉及PTGS2、HSP90AA1、PIK3CA、EGFR等多靶點，體現了連花清瘟顆粒防治COVID-19的多成分、多靶點及多途徑協同調節的優勢。

綜上所述，本研究基于計算機輔助物設計方法對連花清瘟顆粒靶向SARS-CoV-2 S蛋白而抗COVID-19的潛在活性成分和作用機制進行了探討。同時，本研究選擇Zhou等[18]報道的SARS-CoV-2感染人體細胞的關鍵蛋白S蛋白的高分辨晶體結構，對連花清瘟顆粒抗SARS-CoV的成分進行分子對接的虛擬篩選研究，對接結果顯示芹菜素、刺槐素、桔皮素、去甘草查耳酮、甲麻黃堿、大黃素甲醚及血清素7種成分具有靶向SARS-CoV-2 S蛋白的能力，從分子水平上初步證實了連花清瘟顆粒具有直接靶向SARS-CoV-2 S的作用及其潛在活性成分。本研究通過系統性、靶向性兩個角度進一步證明了連花清瘟顆粒通過多成分、多靶點、多途徑全面治療疾病的突出能力，為中醫組方的科學性和潛在療效提供了佐證，也為后續抗COVID-19的中醫遣方用藥提供了一定的理論依據。