當歸補血湯含藥血清對TNF-α誘導HFLS-RA細胞增殖的影響

何艷新， 田 樂， 吉 聰， 王穎航， 潘 志*

(1.長春中醫藥大學人參科學研究院，吉林 長春 130000；2.長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春 130000)

類風濕關節炎是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，主要病理表現為滑膜細胞的異常增殖，形成血管翳而導致滑膜炎癥及進行性骨和關節破壞，滑膜成纖維細胞是病理變化過程中的關鍵效應細胞，在發病中起著重要作用[1-3]。目前，尚無治愈類風濕關節炎的方法，以非甾體抗炎藥及慢性抗風濕藥為主，但起效慢，不良反應大，生物制劑價格昂貴，大多數患者無法長期使用[4]。現代研究表明，中醫藥具有抗氧化、抗炎鎮痛、免疫調節等多種藥理作用，同時具有不良反應少、對肝臟損害較小等優勢，在類風濕關節炎治療上具有一定優勢[5]。

當歸補血湯源自《內外傷辨惑論》，由黃芪、當歸按5∶1比例組成，方中黃芪大補脾肺之氣，當歸養血和營，二者合用，氣血雙補[6]，全方具有抗炎、補氣生血、調節免疫等作用[7-8]，并且課題組前期研究發現其有效成分黃芪甲苷、阿魏酸等對類風濕關節炎療效顯著。因此，本實驗觀察當歸補血湯對人類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞(human fibroblast-like synoviocytes，HFLS-RA)增殖及相關炎癥因子表達的影響，探討該方治療類風濕關節炎的可能機制，為相關研究提供新途徑。

1 材料

1.1 藥物 雷公藤多苷片(上海復旦復華藥業有限公司，國藥準字Z31020415，批號20190520)。當歸、黃芪購自吉林省長春市宏檢大藥房，經長春中醫藥大學蔡廣知副教授鑒定為正品。

1.2 細胞與動物 HFLS-RA細胞購自北京北納創聯生物技術研究院，取3～7代用于實驗。清潔級健康雄性Wistar大鼠42只，體質量(200±20)g，購自吉林省長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，實驗動物生產許可證號SCXK(吉)2011-0004，飼養于長春中醫藥大學動物實驗中心，溫度(23±2)℃，相對濕度(50±5)%。

1.3 試劑及儀器 H-DMEM培養基(美國HyClone公司，批號AE26287263)；MTT(北京索萊寶科技有限公司，批號M8180)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(美國Pepro Tech公司，批號300-01A-10)；轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)ELISA試劑盒(批號CK-E10113H)、白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)ELISA試劑盒(批號CK-E10155H)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)ELISA試劑盒(批號CK-E10140H)、白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)ELISA試劑盒(批號CK-E10082H)(上海優選生物科技有限公司)；PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司，批號DP419)；GAPDH抗體(批號AP0063)、叉頭狀螺旋轉錄因子(fork-head box p3，Foxp3)抗體(批號BS90536)、轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)(批號AP0365)(美國Bioworld公司)；維甲酸相關核孤兒受體γt(retinoic acid-related orphan nuclear receptor γ t，ROR-γt)抗體(批號bs-23019R)、Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP(北京博奧森生物技術有限公司)。離心機(北京大龍興創實驗儀器有限公司，型號DM0412)；恒溫箱(上海和呈儀器制造有限公司，型號DHG-9000/5A)；基因擴增儀(蘇州東勝興業科學儀器有限公司，型號ETC811)；熒光倒置顯微鏡(上海比目儀器有限公司，型號BFM-800E)；培養箱(日本Sanyo公司，型號MCO-18AIC)；超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司，型號SW-CJ-2D)；電泳儀(型號165-8000)、轉膜儀(型號170-3930)(美國Bio-Rad公司)；智能成像系統(美國Thermo Fisher Scientific公司，型號FL1000)。

2 方法

2.1 含藥血清制備 42只SD大鼠按照隨機數字表分為空白組、模型組、雷公藤多苷組及當歸補血湯低、中、高劑量組，每組7只。當歸補血湯按原方黃芪-當歸5∶1配伍比稱取藥材，煎煮濃縮至水煎液含生藥1.5 g/mL，即當歸補血湯高劑量組，同法制備當歸補血湯中、低劑量水煎液，在4 ℃下保存備用。按人與動物體表面積換算得出，灌胃給藥劑量分別為15、7.5、3.75 g/kg，雷公藤多苷給藥劑量為每天6.25 mg/kg[9]，灌胃給藥，每天2次，7 d后腹主動脈采血，收集血清，56 ℃滅活，在-20 ℃下保存備用。

2.2 細胞培養與分組 細胞隨機分為6組，即空白組(10%空白大鼠血清培養基培養細胞)、模型組(20 ng/mL TNF-α+10%空白組大鼠血清培養基)、雷公藤多苷組(20 ng/mL TNF-α+10%雷公藤多苷組大鼠血清培養基)、當歸補血湯低劑量組(20 ng/mL TNF-α+10%當歸補血湯低劑量組大鼠血清培養基)、當歸補血湯中劑量組(20 ng/mL TNF-α+10%當歸補血湯中劑量組大鼠血清培養基)、當歸補血湯高劑量組(20 ng/mL TNF-α+10%當歸補血湯高劑量組大鼠血清培養基)。

2.3 MTT法檢測細胞增殖活力 待細胞生長達到80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，計數，調整密度至1×105/mL。將每孔200 μL細胞懸液接種于96孔板上，按“2.2”項下方法分組、給藥，24 h后每孔加入20 μL MTT，4 h后每孔加入150 μL DMSO，在490 nm波長處檢測光密度(OD)。

2.4 ELISA法檢測細胞上清液中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β水平 按“2.2”項下方法分組和給藥，培養24 h后收集細胞上清，離心，在-20 ℃下保存，按照說明書操作步驟檢測目標因子水平。

2.5 PCR法檢測細胞中Foxp3、ROR-γt、STAT3 mRNA表達 提取總RNA，檢測其純度、濃度、完整性，逆轉錄合成cDNA，反應條件為42 ℃ 50 min，70 ℃ 10 min，再配制50 μL體系擴增，條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s(循環39次)，72 ℃ 15 s，72 ℃ 5 min，每個樣品設置3個復孔，平行3次，檢測目的基因、內參標準灰度值，兩者比值即為目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 Western blot法檢測細胞中Foxp3、ROR-γt、STAT3蛋白表達 提取細胞總蛋白，BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度，制膠(12%分離膠、5%濃縮膠)，上樣后以SDS-PAGE電泳法分離蛋白樣品(80 V、30 min跑上層膠，110 V、90 min跑下層膠)，電泳結束后進行蛋白轉膜(100 V、100 min)，5%脫脂奶粉封閉1 h后，TBST洗膜3次，每次10 min，4 ℃下孵育一抗(GAPDH 1∶2 500，Foxp3 1∶500，ROR-γt 1∶500，STAT3 1∶500)過夜；TBST洗膜3次，每次10 min，室溫搖床上孵育二抗(1∶1 000)1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL化學發光，蛋白凝膠電泳成像儀中進行成像，計算灰度值。

3 結果

3.1 當歸補血湯含藥血清對TNF-α誘導HFLS-RA細胞增殖抑制作用 與空白組比較，模型組HFLS-RA細胞增殖增加(P<0.01)；與模型組比較，雷公藤多苷組、當歸補血湯各劑量組HFLS-RA細胞增殖抑制(P<0.01)，見表2。

表2 當歸補血湯含藥血清對TNF-α誘導HFLS-RA增殖抑制作用

3.2 當歸補血湯含藥血清對TNF-α誘導HFLS-RA細胞上清液中IL-6、IL-17、TGF-β、IL-10水平的影響 與空白組比較，模型組細胞上清液中IL-6、IL-17水平升高(P<0.01)，TGF-β、IL-10水平降低(P<0.01)；與模型組比較，雷公藤多苷組、當歸補血湯高劑量組細胞上清液中IL-6、IL-17水平降低(P<0.01)，TGF-β、IL-10水平升高(P<0.01)；與雷公藤多苷組比較，當歸補血湯高劑量組細胞上清液中IL-6水平降低(P<0.01)，IL-10水平升高(P<0.01)，見表3。

表3 各組HFLS-RA細胞上清液中IL-6、IL-17、TGF-β、IL-10水平比較

3.3 當歸補血湯含藥血清對TNF-α誘導HFLS-RA細胞中ROR-γt、STAT3、Foxp3蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組細胞中ROR-γt、STAT3蛋白表達升高(P<0.01)，Foxp3表達降低(P<0.01)；與模型組比較，雷公藤多苷組和當歸補血湯中、高劑量組細胞中ROR-γt、STAT3蛋白表達降低(P<0.01)，當歸補血湯高劑量組細胞中Foxp3蛋白表達升高(P<0.01)，見圖1。

注:A為蛋白印跡圖，B為蛋白表達統計圖。與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖1 各組HFLS-RA細胞中ROR-γt、STAT3、Foxp3蛋白表達

3.4 當歸補血湯含藥血清對TNF-α誘導HFLS-RA細胞中ROR-γt、STAT3、Foxp3 mRNA表達的影響 與空白組比較，模型組細胞中ROR-γt、STAT3 mRNA表達升高(P<0.01)，Foxp3 mRNA降低(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷組、當歸補血湯高劑量組細胞中ROR-γt、STAT3 mRNA表達降低(P<0.01)，Foxp3 mRNA表達升高(P<0.05，P<0.01)；與雷公藤多苷組比較，當歸補血湯高劑量組細胞中ROR-γtmRNA表達降低(P<0.01)，見表4、圖2。

圖2 各組HFLS-RA細胞中ROR-γt、STAT3、Foxp3 mRNA表達

表4 各組HFLS-RA細胞中ROR-γt、STAT3及Foxp3 mRNA表達比較

4 討論

類風濕關節炎是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，其特征在于關節腫脹、壓痛，嚴重會導致殘疾，潛在病因及發病機制目前尚不明確。成纖維樣滑膜細胞(HFLS-RA)是血管翳-軟骨連接處最常見的細胞類型，可產生細胞因子、趨化因子和基質降解分子遷移并侵入關節軟骨來破壞關節，參與類風濕關節炎的整個過程[10-11]。通過查閱文獻可知，T細胞亞群在類風濕關節炎病理演變中起著非常重要的作用，其分泌的細胞因子也與類風濕關節炎疾病的發生發展密切相關。現代藥理研究表明，當歸補血湯具有免疫調節、造血、抗氧化、抗疲勞等多種藥理作用[12]。本課題組結合前期研究，以HFLS-RA為對象，探當歸補血湯含藥血清治療類風濕關節炎的可能機制。

目前，調節輔助性T細胞17(helperTcells17，Th17)和調節性T細胞(regulatoryTcell，Treg)平衡已成為治療類風濕關節炎疾病的新途徑及新的研究熱點。Th17細胞可導致自身免疫性疾病，但Treg細胞可抑制自身免疫性疾病，兩者在功能和分化過程中相互影響，相互拮抗。Th17細胞是類風濕關節炎疾病的主要參與者，它可產生IL-17、IL-22和IL-23，招募中性粒細胞，促進感染部位的炎癥；Treg細胞產生抗炎因子IL-10和TGF-β，抑制多種免疫細胞的活性[13]。STAT3在T細胞抗原受體(TCR)/共刺激信號刺激下，與TGF-β和IL-6一起被激活[14-15]，然后STAT3誘導轉錄因子RAR相關孤兒受體(ROR)-γt的表達，將細胞引向Th17亞群[16]，如果能夠抑制STAT3的表達等同于抑制ROR-γt的表達，則能減少Th17細胞數量。Treg細胞是由TCR刺激而產生的，導致Foxp3表達增加，Treg細胞數量增多，此外TGF-β在體外也能誘Foxp3+Treg細胞[17]。因此，調節影響和維持多種因素對于Th17/Treg的平衡、抑制炎癥反應對類風濕關節炎發展有著非常重要的作用。

本研究發現，高劑量當歸補血湯干預時TNF-α誘導HFLS-RA細胞的增殖明顯受到抑制，IL-6、IL-17水平及ROR-γt、STAT3mRNA和蛋白表達降低，TGF-β、IL-10水平及Foxp3mRNA和蛋白表達升高。由此認為，當歸補血湯含藥血清對類風濕關節炎滑膜炎癥具有抑制作用，可能通過調節Th17/Treg，維持正常的免疫平衡來發揮作用。