防己與甘草在防己黃芪湯中配伍后3種成分的變化

翟康欣， 遆安航， 李思思， 魏 珊， 裴香萍， 張淑蓉*

(1.山西中醫藥大學中藥學院，山西 晉中 030619；2.山西鑫煜制藥有限公司，山西 晉中 030600)

《金匱要略》記載，防己黃芪湯由防己、黃芪、白術、甘草組成，配伍生姜、大棗煎服，具有益氣祛風、健脾利水之功效，主治風濕或風水之表虛不固、脈浮身重、汗出惡風[1]，現代藥理研究表明該方可用于治療關節炎癥、水腫、風濕免疫、腎臟疾病、肺部疾病等[2]，方中防己主要含有粉防己堿、防己諾林堿等成分，甘草主要含有甘草酸等成分，兩者為酸堿對藥，配伍后可能會形成酸堿復合物沉淀[3]。本實驗參考裴妙榮等[4-6]研究“大黃硝石湯”“四逆湯”“大黃附子湯”的方法，考察防己、甘草單味藥水煎液、防己-甘草對藥水煎過濾液、防己-甘草對藥水煎離心液、全方水煎過濾液、全方水煎離心液、乙醇回流提取液等不同配伍、提取方法處理后粉防己堿、防己諾林堿、甘草酸提取量的變化及酸堿復合物的形成，并考察了酸堿復合物在人工胃液、人工腸液中的解離情況，以期探求堿性藥防己與酸性藥甘草在防己黃芪湯中配伍的化學變化規律，從而為該方藥效物質研究及臨床應用提供參考。

1 材料

Waters高效液相色譜儀系統，配置Miliennum32色譜工作站(美國Waters公司)；電子天平(FA2104 型，上海第二分析儀器廠)；離心機(LD5210型，北京醫用離心機廠)。防己、甘草、黃芪、白術均購自河北安國藥材市場，經山西中醫藥大學裴香萍副教授鑒定為正品。防己諾林堿(批號110793-200605)、粉防己堿(110711-200708)、甘草酸銨(批號110731-200614)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純；水為雙蒸水。

2 方法與結果

2.1 不同配伍提取液制備 按處方比例[防己-黃芪-甘草(蜜炙)-白術=4∶5∶2∶3][1]精密稱取防己、甘草單味藥，防己-甘草對藥，防己黃芪湯全方，第1次加10倍量水浸泡30 min后煎煮45 min，第2次加8倍量水后煎煮30 min，合并煎液，一部分提取液雙層紗布過濾，作為水煎過濾液；另一部分提取液3 000 r/min離心15 min，作為水煎離心液。精密稱取單味藥、對藥及全方，95%乙醇回流提取2次，第1次加10倍量，第2次加8倍量，每次1 h，合并，作為乙醇提取液。另取黃芪、甘草、白術，同法制成缺防己的陰性樣品溶液；取防己、黃芪、白術，同法制成缺甘草的陰性樣品溶液。

2.2 防己生物堿提取量測定

2.2.1 色譜條件 依利特Hypersil BDS色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相0.3%甲醇-二乙胺(73∶27)；體積流量1 mL/min；柱溫室溫；檢測波長242 nm，色譜圖見圖1。由此可知，防己諾林堿、粉防己堿均達到基線分離，陰性無干擾。

1.防己諾林堿 2. 粉防己堿圖1 防己諾林堿、粉防己堿HPLC色譜圖

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱定防己諾林堿、粉防己堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含兩者0.1、0.064 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 精密吸取“2.1”項下水煎過濾液與水煎離心液(相當于1 g防己)，NaOH溶液調節pH至12，等量乙醚萃取5次，合并萃取液，低溫回收，甲醇溶解定容至10 mL量瓶中，搖勻，即得；精密吸取“2.1”項下乙醇提取液(相當于1 g防己)，蒸干，甲醇溶解定容至10 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.2.4 方法學考察 取“2.2.2”項下對照品溶液6份，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，以進樣量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得到方程分別為粉防己堿Y=1 947 266.5X-7 912.8(r=0.999 7)，在0.2～2.0 μg范圍內呈良好的線性關系；防己諾林堿Y=1 672 714.2X-10 025.7(r=0.999 8)，在0.128～1.28 μg范圍內呈良好的線性關系。粉防己堿精密度、穩定性(12 h)、重復性試驗峰面積RSD分別為2.05%、2.90%、2.70%，平均加樣回收率為100.21%，RSD為2.53%；防己諾林堿三者峰面積RSD分別為2.25%、2.92%、2.29%，平均加樣回收率為102.5%，RSD為1.10%，均符合相關要求。

2.2.5 結果分析 精密吸取對照品、供試品溶液各10 μL，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算提取量，結果見表1。由此可知，水煎煮提取液中防己生物堿提取量隨著防己單藥、防己-甘草對藥、防己黃芪湯全方的配伍變化依次降低，離心后更明顯；過濾后防己-甘草對藥生物堿提取總量是防己單藥的81.1%，全方為47.8%；離心后防己-甘草對藥生物堿提取總量是防己單藥的56.7%，全方為35.7%；乙醇回流提取液中防己生物堿提取量與水煎過濾液的變化趨勢相反，即隨著防己單藥、防己-甘草對藥、防己黃芪湯全方的配伍變化，提取量依次增高。

表1 粉防己堿、防己諾林堿提取量測定結果(n=3)

2.3 甘草酸提取量測定

2.3.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流動相0.2 mol/L甲醇醋酸銨-冰醋酸(63∶37∶1)；體積流量1 mg/mL；柱溫室溫；檢測波長250 nm，色譜圖見圖2。由此可知，甘草酸與其他成分達到基線分離，陰性無干擾。

1.甘草酸圖2 甘草酸HPLC色譜圖

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取甘草酸單銨鹽對照品適量，“2.3.1”項下流動相定容至10 mL量瓶中，制成含該成分0.265 0 mg/mL(折合甘草酸為0.259 6 mg/mL)的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 精密吸取“2.1”項下水煎過濾液、水煎離心液(相當于1 g甘草)適量，濃縮至10 mL，“2.3.1”項下流動相定容至25 mL量瓶中，濾過，即得；精密吸取“2.1”項下乙醇提取液(相當于1 g甘草)適量，蒸干，“2.3.1”項下流動相定容至25 mL量瓶中，濾過，即得。

2.3.4 方法學考察 取“2.3.2”項下對照品溶液6份，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，以進樣量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得到方程分別為甘草酸Y=918 952.8X-11 106.4(r=0.999 6)，在0.259 6～3.894 μg范圍內呈良好的線性關系。甘草酸精密度、穩定性(12 h)、重復性試驗峰面積RSD分別為1.14%、2.84%、2.42%，平均加樣回收率為101.6%, RSD為1.72%，均符合相關要求。

2.3.5 結果分析 精密吸取對照品、供試品溶液各10 μL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算提取量，結果見表2。由此可知，水煎煮提取液中甘草酸提取量隨著甘草單藥、防己-甘草對藥、防己黃芪湯全方的配伍變化依次降低，離心比過濾更明顯；過濾后防己-甘草對藥提取量是甘草單藥的67.1%，全方為39.5%；離心后防己-甘草對藥提取量是甘草單藥的53.5%，全方為29.9%；乙醇回流提取液中甘草酸提取量隨著甘草單藥、防己-甘草對藥、防己黃芪湯全方的配伍變化也依次降低，但不如水煎過濾液明顯。

表2 甘草酸提取量測定結果(n=3)

2.4 水煎沉淀物在人工胃液、人工腸液中的溶解性 取“2.1”項下離心沉淀物，分別溶于15 mL人工胃液、腸液中，38 ℃水浴攪拌15 min，離心，精密吸取上清液5 mL，加入15 mL 95%乙醇，沉淀，濾過，濾液水浴蒸干，甲醇定容至5 mL，搖勻，即得供試品溶液。精密吸取上述對照品、供試品溶液各10 μL，在“2.2.1”“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算提取量，結果見表3。由此可知，人工胃液、腸液中均檢測到粉防己堿、防己諾林堿、甘草酸，但人工胃液中三者提取量明顯低于人工腸液中，特別是防己黃芪湯全方。

表3 粉防己堿、防己諾林堿、甘草酸提取量測定結果(n=3)

3 討論

本實驗參考《中國藥典》及文獻[7-11]報道建立了不同配伍防己黃芪湯中防己生物堿、甘草酸含量的測定方法，并進行方法學考察，發現該方法準確快速，簡便易行。再分別采用水煎煮過濾、水煎煮離心、乙醇回流提取方法比較不同配伍的防己黃芪湯，發現堿性防己與酸性甘草在合煎時形成了酸堿復合物沉淀，導致提取量減損，全方提取量進一步降低，說明方中黃芪、白術會促進沉淀生成；水煎煮離心上清液中生物堿提取量低于水煎煮過濾液中，可能是離心處理使煎液沉淀物更完全沉淀所致；以甘草/防己單藥、防己-甘草對藥、防己黃芪湯全方為順序，乙醇提取液中甘草酸提取量隨配伍變化依次降低，防己生物堿提取量隨配伍變化依次提高，表明酸堿對藥主要在水煎液中形成復合物沉淀，乙醇作為提取溶劑不宜酸堿性成分相互反應，與段秀俊等[6]報道的結果相似，這也印證了甘草酸與生物堿在酸性環境下易析出沉淀，而調至堿性環境后則不易出現的前期報道[12]。另外人工胃液、人工腸液中防己-甘草水煎沉淀物溶解性的測定結果顯示，兩者均發現防己生物堿、甘草酸，表明配伍后生成的復合物沉淀依然可能會在胃液及腸液的作用下重新解離出有效成分，從而發揮藥效。

近年來，酸堿藥對配伍產生沉淀的現象越來越受到重視，研究者已對其結構有所研究[13-16]。裴妙榮等[17]推斷，四逆湯中酸堿復合物的形成是由于甘草酸糖鏈第2個葡萄糖醛酸的羧基與烏頭堿中的氮原子締合生成離子締合物。本實驗發現，堿性成分為防己生物堿，其結構中的氮原子類似烏頭堿，均為叔胺結構，推測它與甘草酸形成復合物結構最可能類似烏頭堿，即甘草酸結構中糖鏈第2個葡萄糖醛酸的羧基與防己生物堿的氮原子發生締合，生成離子締合物(圖3)。但由于甘草酸分子中有3個羧基，防己生物堿有2個叔氮原子，其反應摩爾比存在多種可能，情況更復雜，有待今后進一步分離沉淀，并用核磁等手段鑒定結構。

圖3 甘草酸與防己生物堿水煎煮締合反應圖