喘貼靈巴布劑處方工藝優化及其體外透皮特性

李姿銳， 鄒蘇蘭， 陸慧玲， 李 雅

(湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

支氣管哮喘是常見的炎癥性氣道疾病，感染了世界上超過10%的人口[1-2]。雖然西醫能有效控制癥狀，但其不良反應大，用藥療程長，患者順應性差，停藥后易反復發作，導致療效不理想[3-4]。

喘貼靈由芥子、麻黃、細辛等8味藥材組成，具有益氣活血、補肺固腎作用，臨床上將其穴位貼敷來治療支氣管哮喘，作用顯著，可明顯降低氣道反應性，抑制炎癥介質釋放，延長哮喘潛伏期，從而改善哮喘氣道變應性炎癥[5-6]。巴布劑是一種新型透皮給藥制劑，主要由水溶性高分子骨架材料、交聯劑、保濕劑、填充劑、提取物等組成，具有避免肝臟首過效應、載藥量大、與皮膚生物相容性好、透氣、可反復貼敷，生物利用度高、藥物透皮吸收效率高、減少胃腸刺激等優點，近年來受到大量科研工作者的重視，也成為國內外醫藥行業開發的熱點[7-8]。本實驗將喘貼靈制成巴布劑，并考察其體外透皮特性，以期為該制劑進一步開發利用提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀，配置Agilent ChemStation色譜工作站(美國Agilent公司)；CZY-GY初黏力測定儀(濟南蘭光機電技術有限公司)；CP114電子天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；TP-6智能透皮擴散儀(天津精拓儀器科技有限公司)；RE-2000A旋轉蒸發器(鞏義市中天儀器科技有限公司)；DZTW型調溫電熱套(北京市永光明醫療儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 NP-700(昭和電工株式會社，批號931170A)；甘氨酸鋁(上海麥克林生化科技有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮K90(PVP K90)；氮酮(天津市瑞金物化學品有限公司，批號20190620)；甘油(國藥集團化學試劑有限公司，批號20191014)；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(湖南匯虹試劑有限公司，批號10180131)。細辛(批號20110412)、麻黃(批號20120806)、芥子(批號19070809)、丁香(批號20071605)、肉桂(批號20112103)、醋延胡索(批號20122306)、醋甘遂(批號19090404)均購自湖南振興中藥有限公司，經專家鑒定為正品。芥子硫氰酸鹽(純度98.3%，批號111702-202102)、鹽酸麻黃堿(純度100%，批號171241-20201)對照品(中國食品藥品檢定研究院)。所用試劑均為色譜純；蒸餾水由湖南中醫藥大學模擬藥廠提供。

2 方法與結果

2.1 浸膏制備 稱取芥子30 g、麻黃20 g、細辛6 g、丁香20 g、肉桂20 g、延胡索20 g、甘遂20 g、生姜汁20 g，8倍量蒸餾水提取2次，提取時間分別為1.5、1 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮，即得。

2.2 巴布劑制備 稱取處方量PVP K90，加入純化水，水浴溶解10 min，作為A相；另取處方量的NP-700、甘氨酸鋁混勻，再加入甘油和促滲劑，在60 ℃下攪拌6 min，作為B相；取處方量浸膏、EDTA、高嶺土，溶于20 g水中，作為C相，將A相緩慢加到B相中，攪拌均勻，再加入C相，繼續攪拌均勻，立即涂布于無紡布上，放置1 d，即得。

2.3 巴布劑質量評價

2.3.1 感官評分 參考文獻[9]報道，以外觀性狀、涂展性、膜殘留量、皮膚追隨性、反復粘貼性為主觀考察指標，總分40分，具體見表1。

表1 感官評分標準

2.3.2 初黏力 采用滾球斜坡停止法，板上有2條相隔10 mm的水平線，上線為鋼球起始位置的標記，下線為供試品固定的標記。取巴布劑(10 cm×4 cm)，揭去防黏層，將上端固定在下線位置，黏性面向上，調節底座使鋼板表面與水平面成30°傾斜，從大到小的順序取鋼球從水平線的上線自由滾落，記錄巴布劑能黏住的最大鋼球號，滿分20分，其余與其相比依次評分。

2.3.3 持黏力 將巴布劑黏性面粘貼于試驗板表面，垂直放置，沿長度方向懸掛1個規定質量的砝碼，記錄滑移直至脫落的時間，重復3次，取平均值，滿分20分，其余與其相比依次評分。

2.3.4 剝離強度 取巴布劑(10 cm×4 cm)，揭去防黏層，粘貼于實驗板表面，垂直放置，上端懸掛200 g砝碼，記錄脫落所需時間，重復3次，取平均值，滿分20分，其余與其相比依次評分。

2.3.5 綜合評分 根據2020版《中國藥典》結合文獻[10-11]報道，設定感官評分、初黏力、持黏力、剝離強度權重系數分別為0.4、0.2、0.2、0.2，計算綜合評分，公式為綜合評分=0.4*感官評分+0.2*初黏力+0.2*持黏力+0.2*剝離強度。

2.4 Plackett-Burman設計 在前期實驗及預試驗基礎上，選擇NP-700(A)、PVP K90(B)、甘氨酸鋁(C)、EDTA(D)、甘油(E)、高嶺土(F)用量作為影響因素，每個因素取1、-1水平，具體見表2，結果見表3。

表2 Plackett-Burman設計因素水平

表3 Plackett-Burman設計結果

通過Minitab軟件對表2數據進行多元回歸擬合分析，得方程為Y=36.6-4.15A+14.36B-41.1C+3.6D+1.066E+12.42F，結果見表4。由此可知，模型P<0.05，表明它具有顯著性；相關系數R2為0.867 9，表明模型可較好地描述結果；各因素影響程度依次為E>A>F>B>C>D。

表4 Plackett-Burman方差分析

2.5 Box-Behnken響應面法 在Plackett-Burman設計基礎上，確定甘油(A)、NP-700(B)、高嶺土(C)用量作為影響因素，外觀性狀(D)、初黏力(E)、持黏力(F)、剝離強度(G)的綜合評分作為評價指標，因素水平見表5，結果見表6。

表5 Box-Behnken響應面法因素水平

表6 Box-Behnken響應面法設計與結果

圖1 各因素響應面圖

表7 Box-Behnken響應面法方差分析

2.6 設計空間建立 根據Design-Expert 10.0軟件所得數學模型，采用MODDE 12.1軟件開發設計空間。由于巴布劑綜合評分大于80分，故故設置其優化標準為80，最大限度為100。再通過Monte Carlo法獲取基于達標概率的設計空間，首先進行仿真模擬實驗，獲得實驗測定誤差來計算達標概率，以綜合評分滿足優化標準時為達標，設置模擬次數為5 000次，結果見圖2。由此可知，設計空間為綠色區域，該區域時中甘油、高嶺土用量等條件的改變不會對巴布劑綜合評分造成影響，數字表示工藝參數落在該范圍內綜合評分不能達到優化標準的概率，其值越小，顏色由紅變綠，代表滿足優化標準的可能性逐漸增加。最終確定，推薦的操作空間為甘油用量30～36 g，NP-700用量5～6 g，高嶺土用量0.6～0.833 g。

圖2 各因素設計空間

在設計空間范圍內制備2份喘貼靈巴布劑(P1、P2)，測定各項指標，平行3次，計算綜合評分，結果見表8。由此可知，該范圍內所制備的巴布劑外觀光潔有彈性，初黏力、持黏力良好。

表8 驗證試驗結果(n=3)

再對巴布劑載藥性能進行考察，結果見表9。由此可知，載藥量在10%～40%時性能較穩定，但低于10%或超過40%時綜合評分明顯降低。在不影響性能的前提下，應使巴布劑盡可能多地載藥以確保療效，故設定其最大載藥量為40%。

表9 巴布劑載藥性能考察結果

2.7 各成分含量測定

2.7.1 供試品溶液制備 精密稱取巴布劑1.0 g，置于錐形瓶中，精密加入10 mL甲醇，超聲處理30 min，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，即得。

1. 鹽酸麻黃堿 2. 芥子堿硫氰酸鹽圖3 各成分HPLC色譜圖

2.7.2 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸麻黃堿、芥子堿硫氰酸鹽對照品適量，甲醇溶解，制成分別含兩者0.24、0.34 mg/mL的溶液，即得。

2.7.3 色譜條件 SinoChrom ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀(0～40 min，10∶90)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm。色譜圖見圖3。

2.7.4 線性關系考察 取“2.7.2”項下對照品溶液適量，甲醇稀釋(鹽酸麻黃堿質量濃度分別為0.001 67、0.005、0.012 5、0.025、0.033 mg/mL，芥子堿硫氰酸鹽質量濃度分別為0.013 3、0.016 7、0.025、0.033、0.05 mg/mL)，分別精密吸取10 μL，在“2.7.3”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積(Y)對其質量濃度(X)進行回歸，得方程分別為鹽酸麻黃堿Y=20 304X-21.03(r=0.999 2)，線性范圍1.67～33.0 mg/mL；芥子堿硫氰酸鹽Y=19 193X-250.24(r=0.999 5)，線性范圍13.3～50 mg/mL。

2.7.5 精密度試驗 精密吸取“2.7.2”項下對照品溶液(鹽酸麻黃堿、芥子堿硫氰酸鹽質量濃度分別為25.0、33.0 mg/mL)10 μL，在“2.7.3”項色譜條件下進樣測定6次，測得鹽酸麻黃堿、芥子堿硫氰酸鹽峰面積RSD分別為 0.17%、0.43%，表明儀器精密度良好。

2.7.6 穩定性試驗 精密吸取“2.7.1”項下供試品溶液，于0、0.5、1、1.5、3、6、12、24 h在“2.7.3”項色譜條件下進樣測定，測得鹽酸麻黃堿、芥子堿硫氰酸鹽峰面積RSD分別為1.03%、0.59%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.7.7 重復性試驗 精密稱取巴布劑6份，按“2.7.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.7.3”項色譜條件下進樣測定，測得鹽酸麻黃堿、芥子堿硫氰酸鹽含量RSD分別為1.58%、0.93%，表明該方法重復性良好。

2.7.8 加樣回收率試驗 精密吸取各成分含量已知的供試品溶液3 mL，共6份，分別精密加入80%、100%、120%水平對照品溶液，在“2.7.3”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，鹽酸麻黃堿平均加樣回收率為100.22%，RSD為1.13%；芥子堿平均加樣回收率為99.78%，RSD為0.91%。

2.8 體外透皮實驗 預實驗選擇氮酮、尿素、冰片、油酸、薄荷油作為透皮促滲劑[12]進行考察，發現氮酮、薄荷油對巴布劑的促透效果更優。本實驗采用Franz擴散池法考察氮酮、薄荷油用量，HPLC法測定各時間點巴布劑君藥(芥子、麻黃)中抗哮喘成分(芥子堿硫氰酸鹽、鹽酸麻黃堿)的滲透量。

2.8.1 透皮促滲劑用量選擇 根據“2.6”項下優化操作空間，分別加入1%、3%、5%氮酮、薄荷油制備巴布劑。

2.8.2 離體大鼠皮膚制備 脫毛膏去除大鼠腹部毛發，正常飼養1 d后取皮，去掉皮下脂肪，生理鹽水洗凈黏液組織，即得，置于-20 ℃冰箱中冷凍保存，實驗前自然解凍。

2.8.3 透皮實驗 將“2.8.2”項下皮膚在37 ℃生理鹽水中解凍，固定于Franz透皮擴散池上(接收池體積為20 mL，接收面積為7.065 cm2)，表皮層朝上面向供給池，真皮層朝面向接收池，排凈氣泡，將含有不同用量透皮促滲劑的巴布劑緊貼于皮膚上，接收介質為生理鹽水，恒溫(32 ℃)攪拌(300 r/min)，于 2、4、6、8、10、12、24 h取出接收介質各0.8 mL，同時向接收池中補充等溫同體積生理鹽水，0.45 μm微孔濾膜過濾，采用HPLC法測定鹽酸麻黃堿、芥子堿硫氰酸鹽含量，計算累積滲透量Qn，公式為Qn=(V總Cn+ΣCn-1V取)/A，其中V總為接收池體積(20 mL)，Cn為第n個取樣點鹽酸麻黃堿或芥子堿硫氰酸鹽含量，Cn-1為第n-1個取樣點鹽酸麻黃堿或芥子堿硫氰酸鹽含量，V取為取樣體積(0.8 mL)，A為滲透面積(7.065 cm2)，累積滲透量-時間曲線見圖4，再測定速率倍增系數(ER)、體外透皮速率(J)，結果見表10。

圖4 各成分累積滲透量-時間曲線

表10 不同透皮促滲劑對巴布劑累積滲透量的影響(n=3)

由此可知，當不加入透皮促滲劑時，芥子堿硫氰酸鹽體外透皮速率高于鹽酸麻黃堿，而加入后2種成分體外透皮速率明顯升高；氮酮促滲作用與其用量不成正比關系，當大于1%時2種成分促滲速率反而被抑制；薄荷油用量為3%時對鹽酸麻黃堿的促滲效果最強，但與1%氮酮相比無明顯差異，而且后者對芥子堿硫氰酸鹽有顯著促滲作用顯著。最終，選擇1%氮酮作為透皮促滲劑。

3 討論

3.1 基質篩選 在基質處方設計中，NP-700為骨架材料，甘氨酸鋁為交聯劑，兩者交聯形成三維網狀結構，使巴布劑具有較高的彈性和黏性[13]，其中PVP K90為增黏劑，EDTA為螯合劑，甘油為保濕劑，高嶺土為無機填充劑，可調節其成型性、涂展性，增加膏體強度。同時，在制備C相的過程中利用高嶺土結構疏松多孔，能吸附提取物中揮發油等油性物質的特性，將其與喘貼靈浸膏混合均勻，可提高其療效[14]。

3.2 優化設計方法篩選 QbD理念強調增加對生產過程可靠控制，建立全方位易于開展的控制平臺，有利于實際生產和操作[15-17]。本實驗將該理念應用于喘貼靈巴布劑的工藝制備過程，結合Box-Behnken響應面法進行優化，構建了關鍵質量屬性、關鍵工藝參數的工藝設計空間。在相關生產過程中，可根據實際情況對工藝參數在操作空間內進行調整，從而保障喘貼靈巴布劑的質量可控性。

3.3 體外透皮研究 喘貼靈中芥子、麻黃為君藥，故本實驗選擇兩者主要質量控制指標成分作為體外透皮試驗檢測指標，其中鹽酸麻黃堿、芥子堿硫氰酸鹽治療哮喘療效顯著[18-21]。再考察了透皮促滲劑種類及用量，其中氮酮無味，無不良反應、性質穩定，可廣泛用于促進透皮給藥制劑的滲透中[22-24]，并且當其用量大于1%時麻黃堿、芥子堿透皮速率顯著降低，表明促透作用并不隨者用量增加而提高。