丁香揮發油對參黃散中有效成分的透皮促滲作用

劉興亮， 王 博， 李 瑋， 關 旸， 張 婷， 丁美紅， 石森林

(浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053)

丁香是桃金娘科植物丁香EugeniacaryophyllataThunb.的干燥花蕾，主要成分是揮發油、苷類等，其中揮發油主要組成是丁香酚[1]，可將蛋白質變性，從而影響細胞膜上的磷脂雙分子層，改變細胞膜的通透性，可能是其發揮促滲作用的機制。參黃散是國家級名老中醫徐志瑛的經典名方, 由生曬參、丹參、大黃、厚樸、枳實、吳茱萸、丁香7味藥材組成，臨床上主要用于術后腸動力障礙的治療，將其敷貼于神闕穴時療效顯著[2-3]，其中丁香揮發油具有良好的透皮吸收作用，可增加全方藥用功效，在促滲方面優于化學促滲劑[4-6]。但目前對中藥揮發油的研究只針對其所含某成分的透皮吸收作用，尚無同一揮發油對于不同活性成分的促滲規律。為了科學評價丁香揮發油對參黃散中有效成分的透皮促滲作用，本實驗通過傅里葉紅外色譜、組織病理、掃描電鏡、免疫組化檢測E-鈣黏素(上皮黏附分子，介導細胞之間的粘附)等方法觀察該成分對大鼠皮膚結構的改變情況，探析其促滲規律，以期為今后研究處方配伍中的具體劑量提供參考。

1 材料

JA2003N電子天平(上海精密儀器有限公司)；XS105分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Agilent 7890-5977A氣相色譜-單四級桿質譜聯用儀、Agilent 1200series高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；RE-3000旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器有限公司)；SCIENTZ-IID型超聲細胞破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)；SHZ-80恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)；Avanti J-26XP系列高效離心機[貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司]；EQUINOX55傅里葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司)；AXIO SCOPE.A1正置顯微鏡(德國卡爾·蔡司公司)；SU8010型場發射掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；病理組織漂烘機、RM2245石蠟切片機、Autostainer XL全自動染色劑(德國徠卡公司)；AP280-1石蠟包埋機(德國MicRom公司)。

對照品大黃素(純度≥98%，批號TO2S8F42983)、丹參酮ⅡA(純度≥98%，批號Y20J8C40264)、厚樸酚(純度≥98%，批號Y27J10C91584)；吳茱萸堿(純度≥98%，批號X26A8P34704)(上海源葉生物科技有限公司)；辛弗林(純度≥98%，批號L1819126)[阿拉丁試劑(上海)有限公司]。月桂氮卓酮(芮城縣壹善中間體有限公司)；E-cadherin抗體(英國Abcam公司)。丁香、大黃、丹參、厚樸、枳實、吳茱萸均購自浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司，經專家鑒定為正品。甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

SPF級雄性SD大鼠，體質量180～220 g，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK(滬)2018-0006。

2 方法與結果

2.1 揮發油提取 稱取丁香200 g，置于圓底燒瓶中，加10倍量水浸泡12 h，采用2020年版《中國藥典》中的水蒸氣蒸餾法提取8 h，即得(具有濃郁香味的無色透明液體)，共27.5 mL，得率為13.75%，置于4 ℃冰箱中密封保存。

2.2 揮發油成分分析 參考文獻[7]報道。

2.2.1 樣品前處理 稱取適量揮發油，無水硫酸鈉處理，無水乙醇溶解。

2.2.2 分析條件

2.2.2.1 色譜 載氣高純度氦氣，分流比20∶1，體積流量1.0 mL/min；程序升溫(初始50 ℃，以5 ℃/min升至200 ℃，再以10 ℃/min升至300 ℃)；進樣量1 μL。

2.2.2.2 質譜 EI離子源溫度200 ℃；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z30～500。

2.2.3 結果分析 采用全掃描模式，采集1.00 mg/L揮發油溶液，總離子流圖見圖1，將結果與NIST標準譜庫進行匹配度檢查，發現保留時間12.12、13.53、14.37、16.51 min處的成分分別為丁香酚、石竹烯、蛇麻烯、乙酰丁香酚，面積歸一化法測定其相對含量，結果見表1。

表1 揮發油主要成分相對含量測定結果

圖1 揮發油總離子流圖

2.3 在體皮膚滲透實驗

2.3.1 浸膏制備 將參黃散中5種組方藥材(大黃、丹參、枳實、厚樸、吳茱萸)粉碎，分別稱取200 g，置于圓底燒瓶中，加入10倍量80%乙醇減壓回流提取2次，每次1 h，濾過，收集合并濾液，即得。

2.3.2 分組與給藥 將大鼠隨機分為10組，分別為大黃浸膏組、大黃浸膏+揮發油組、丹參浸膏組、丹參浸膏+丁香組、厚樸浸膏組、厚樸浸膏+揮發油組、吳茱萸浸膏組、吳茱萸浸膏+揮發油組、枳實浸膏組、枳實浸膏+揮發油組，每組5只，尾部標號背部剃毛，自然飼養恢復1 d，背部脫毛左右位置分為2個區域，分別為各藥材浸膏組(0.72 g)、各藥材浸膏+揮發油組(0.72 g+20 μL)，將兩者涂于皮膚表面，空白巴布貼覆蓋(6 cm×6 cm，內徑2 cm)，醫用膠帶纏繞固定。12、24 h后處死大鼠，取下給藥處皮膚，洗凈，剪碎，勻漿機將組織勻漿至乳糜狀，冰浴下采用探頭超聲提取30 min，在恒溫搖床中繼續提取12 h，將離心管在4 ℃、3 000 r/min下離心30 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，采用HPLC法測定大黃素、丹參酮ⅡA、厚樸酚、吳茱萸堿、辛弗林含量[8]，計算其皮膚滯留量，公式為皮膚滯留量=(藥物質量濃度×提取液體積)/給藥面積。

2.3.3 結果分析 表2顯示，在體透皮12、24 h后，各藥材浸膏+揮發油組大鼠皮膚中各成分滯留量均高于各藥材浸膏組，表明揮發油具有明顯的促滲作用，可能與該成分可降低皮膚屏障功能有關。

表2 各成分在體透皮皮膚滯留量

2.4 揮發油對大鼠皮膚結構的影響

2.4.1 角質層采集 參考文獻[9]報道，將大鼠腹部皮膚置于0.5%胰酶溶液中，室溫放置12 h，更新胰酶溶液，繼續放置12 h，然后用棉簽小心剝離皮膚角質層，蒸餾水洗凈，置于真空干燥箱中干燥。

2.4.2 分組與給藥 取1 cm×1 cm角質層，隨機分為溶劑組、生理鹽水-無水乙醇(2∶3)組、0.5%揮發油組、0.5%氮酮組，向試管中加入相應溶液約10 mL，室溫靜置12 h，蒸餾水將角質層表面沖洗干凈，濾紙吸干，真空干燥，采用全反射傅里葉紅外變換光譜(ATR-FTIR)對干燥后的角質層進行掃描分析。

2.4.3 結果分析 表3、圖2顯示，與溶劑組比較，揮發油組皮膚角質層CH2非對稱振動峰、對稱振動峰均向高峰位移動，表明該成分可使皮膚角質層脂質結構或構象發生改變；振動Ⅰ峰向高峰位移動，振動Ⅱ峰產生裂峰，表明皮膚角質層中角蛋白構象可能有所變化[10]。

表3 皮膚角質層脂質、酰胺振動峰位移

注：a～c分別為揮發油組、氮酮組、溶劑組。圖2 大鼠皮膚角質層ATR-FTIR圖譜

2.5 大鼠皮膚結構觀察(光鏡) 大鼠背部脫毛后自然恢復1 d，按“2.3.2”項下方法給藥，24 h后處死，取用藥部位皮膚，10%甲醛固定24 h，常規石蠟切片，進行HE、免疫組化染色。

圖3顯示，對照組大鼠皮膚角質層緊密排列在活性表皮上，角質層呈帶狀均勻分布，無角質層脫落或游離；氮酮組、揮發油組大鼠皮膚角質層脫落現象較明顯，一些區域外層角質呈帶狀游離，表明揮發油改變了皮膚角質層有序致密結構，使其變得疏松，從而降低了皮膚的屏障作用[11]。

圖3 各組大鼠皮膚角質層HE染色

E-cadherin是重要的細胞間連接分子, 可維持細胞形態、細胞運動及黏附功能，廣泛分布于上皮細胞(基底層和棘層細胞間)中，其低表達表明細胞間粘附作用減弱，皮膚通透性增加，使藥物更容易穿透皮膚[12-13]。圖4顯示，對照組大鼠角質層皮膚中E-cadherin分布和表達較深，而氮酮組、揮發油組較淺。

圖4 各組大鼠皮膚角質層免疫組化染色

2.6 大鼠皮膚結構觀察(掃描電鏡) 將大鼠皮膚隨機分為對照組、揮發油組，分別涂抹大黃浸膏、含有丁香揮發油的大黃浸膏，立即處死，取皮，置于生理鹽水中漂洗，剪切成適宜大小，室溫下固定于2.5%戊二醛固定液中12 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液中漂洗3次，每次10 min，再置于1%鋨酸中固定1 h，依次經50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→乙醇→乙醇→50%叔丁醇→70%叔丁醇→80%叔丁醇→90%叔丁醇→叔丁醇→叔丁醇各脫水10 min，完全干燥后在掃描電鏡下觀察。

圖5顯示，對照組大鼠皮膚表面光滑，角質層細胞緊密堆積排列，裂隙較窄，部分細胞碎屑及其分泌物附著于表皮上；揮發油組大鼠表皮折皺明顯增多，角質層脫落較明顯，表皮間裂隙增寬，角質層明顯疏松，可見孔穴樣結構。

圖5 各組大鼠皮膚橫切面形態

圖6顯示，對照組大鼠表皮角質層結構比較緊密，各層之間無明顯間隙；揮發油組大鼠表皮角質層結構出現松動，各層之間出現明顯間隙。

圖6 各組大鼠皮膚縱切面形態

3 討論與結論

皮膚角質層致密的網絡結構是藥物經皮吸收的主要屏障，其所含脂質成分及角蛋白結構、構象等發生變化時，可導致其通透性及屏障作用改變。研究表明，丁香揮發油對多種藥物的經皮吸收具有促透作用，但其促透機制不明確。

本實驗發現，丁香揮發油可通過影響大鼠皮膚角質層的脂質和角蛋白構象來增加其流動性，降低皮膚屏障功能，從而發揮經皮促滲作用；對參黃散有效成分均有明顯促滲作用，強度依次為厚樸酚>丹參酮ⅡA>大黃素>吳茱萸堿>辛弗林，其機制除了與該成分可降低皮膚屏障功能有關外，還可能因為它由親脂劑組成，更有利于對親脂藥物的滲透。

HE染色顯示，丁香揮發油改變了大鼠皮膚角質層的有序致密的結構，從而降低其屏障作用。與對照組比較，揮發油組皮膚E-cadherin水平降低,表明該成分促滲作用還與細胞黏附分子減少有關。在掃描電鏡下發現，丁香揮發油處理過的皮膚表皮皺折明顯增多，角質層脫落明顯，表皮角質層結構松動。

綜上所述，丁香揮發油對參黃散中有效成分具有優良的透皮促滲作用，可為該方治療術后腸動力障礙提供實驗支持，也為相關經皮給藥制劑開發提供依據。