廣藿香化學型分型及形成時期研究

歐曉華， 羅可可， 鄧文靜， 張眾生， 劉小華， 嚴寒靜*

[1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；2.島津企業管理(中國)有限公司，廣東 廣州 510670]

廣藿香Pogostemoncablin(Blanco)Benth.為唇形科植物，干燥地上部分入藥，為著名的“十大南藥”之一[1]，也是藿香正氣液、連花清瘟膠囊等中成藥的重要原料，功效芳香化濕、健運脾胃、辟穢解毒[2-3]。廣藿香主要分為醇型和酮型2種化學型，以百秋李醇、廣藿香酮的含量比值為劃分依據[4]。質優效佳的道地藥材石牌廣藿香與品質相近的高要廣藿香的廣藿香酮含量遠高于百秋李醇，為酮型廣藿香，在胃腸道疾病等方面藥用效果較好；海南、湛江、陽春等產地的廣藿香大多用于提取揮發油，百秋李醇含量遠高于廣藿香酮，為醇型廣藿香，具有抗病毒、抗炎、抗幽門螺旋桿菌作用[5-7]。由于種質退化、產量及經濟效益降低，道地藥材牌香及質量相近的高要廣藿香瀕臨滅絕，市面上大多為海南、陽春、湛江等產區藥材。為了研究2種化學型廣藿香組培苗生長過程中百秋李醇和廣藿香酮的動態變化規律，探究廣藿香化學型的成因，本實驗采用組培快繁技術，以海南、高要廣藿香為研究對象，分別培養獲得不同生長時期的醇型和酮型廣藿香組培苗，采用GC-MS法評價不同生長時期2種化學型廣藿香組培苗中化學成分差異。

1 材料

1.1 藥材 廣藿香葉片(產地海南省萬寧市、廣東省肇慶市高要區蓮塘鎮)，經廣東藥科大學中藥學院嚴寒靜教授鑒定為唇形科植物廣藿香Pogostemoncablin(Blanco) Benth.的葉片。

1.2 儀器 GC-MS QP-2020(日本島津公司)；RE-52A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-250E數控超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius BP211D電子分析天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司)；電子分析天平[萬分之一，奧豪斯儀器(上海)有限公司]；HH-6恒溫水浴鍋(江蘇金壇市鴻科儀器廠)。

1.3 試劑 百秋李醇(批號B-037-180122，純度>98%)、廣藿香酮(批號G-055-180710，純度>98%)對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；十八烷(批號0110583，純度>98%)對照品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；技術瓊脂粉(批號3207102)購自廣東環凱微生物生物科技有限公司。正己烷(色譜純)、二氯甲烷(分析純)均購自天津市致遠化學試劑有限公司。

1.4 培養基 叢生芽培養基，配方為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；生根培養基，配方為1/2MS，pH值均為5.8～6.0。

2 方法與結果

2.1 植物組織培養 將醇型、酮型廣藿香葉片用自來水沖洗1～2 min，75%酒精漂洗5 s，無菌水漂洗2次，0.1%升汞溶液消毒滅菌8 min，無菌水漂洗5次。葉片剪成5 mm×5 mm葉塊，接種到叢生芽培養基，從萌芽開始計算生長時間，在40 d時選取生長健壯、長勢一致(高1～2 cm)的不定芽，接種至1/2MS培養基中繼續進行生根培養，設定條件為培養溫度(25±1) ℃，光照強度2 000 lx，光照時間14 h/d。每隔30 d分別取出30瓶組培苗，凈制，晾干，在4 ℃下保存備用。

生根培養20 d后(瓶內苗生長60 d時)，取出醇型、酮型生根組培苗各200瓶，水培1周后移植至相同的土壤中，澆以0.5%滅菌靈、0.2%生根粉混合溶液，每隔30 d收取20棵組培苗，凈制，晾干，在4 ℃下保存備用。

2.2 百秋李醇、廣藿香酮含量測定

2.2.1 供試品溶液制備 取粗粉約0.5 g至錐形瓶中，加入二氯甲烷30 mL，超聲處理3次，每次20 min，濾過，合并濾液，回收溶劑，殘渣加正己烷溶解，轉移至5 mL量瓶中，正己烷溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 對照品、內標溶液制備 精密稱取百秋李醇、廣藿香酮對照品適量，正己烷定容至1 mg/mL，即得對照品溶液。精密稱取正十八烷對照品0.5 mg，正己烷定容至1 mL，即得內標溶液。

2.2.3 分析條件 GC-MS色譜圖見圖1。

2.2.3.1 色譜 DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升溫(初始120 ℃，保持2 min，2 ℃/min升至160 ℃，保持2 min，10 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，30 ℃/min升至280 ℃)；分流比30∶1；載氣高純氦氣；柱箱溫度120 ℃；進樣口溫度250 ℃；接口溫度250 ℃；進樣量1 μL。

2.2.3.2 質譜 EI離子源，溫度200 ℃；電離能量70 eV；掃描質量范圍m/z50～500(百秋李醇m/z138，廣藿香酮m/z168，十八烷m/z57)；溶劑延遲2 min。

注：A為對照品，B為瓶內生長210 d醇型組培苗，C為移栽自然環境生長240 d醇型組培苗，D為瓶內生長300 d酮型組培苗，E為移栽自然環境生長240 d酮型組培苗。1.百秋李醇 2.廣藿香酮 3.十八烷1.patchouli alcohol 2.pogostone 3.octadecane圖1 各成分GC-MS色譜圖Fig.1 GC-MS chromatogram of various constituents

2.2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，制成系列質量濃度，在“2.2.2”項條件下測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程分別為百秋李醇Y=304.65X-0.002(R2=0.999 2)，在0.000 1～0.01 mg/mL范圍內線性關系良好；廣藿香酮Y=593.25X-1.659 1(R2=0.999 6)，在0.001～0.4 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，在“2.2.2”項條件下進樣測定6次，測得百秋李醇、廣藿香酮峰面積RSD分別為0.28%、0.91%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12、24 h在“2.2.2”項條件下進樣測定，測得百秋李醇、廣藿香酮峰面積RSD分別為1.21%、2.12%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取同一批樣品6份，在“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項條件下進樣測定，測得百秋李醇、廣藿香酮峰面積RSD分別為4.82%、2.70%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取同一批各成分含量已知的樣品約0.25 g，共6份，精密加入對照品溶液，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項條件下進樣測定，計算回收率，結果見表1。

表1 各成分加樣回收率試驗結果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests for various constituents(n=6)

2.3 樣品含量測定 結果見表2。

表2 各成分含量測定結果(n=3)Tab.2 Results of content determination of various constituents(n=3)

2.4 醇型廣藿香組培苗指標成分動態變化 隨著生長時間延長，醇型廣藿香培養瓶內生長組培苗中百秋李醇含量在0.019～0.151 mg/g范圍內先降后升，而廣藿香酮含量升高；在30～210 d，廣藿香酮含量均高于百秋李醇，見圖2A。

隨著生長時間延長，移栽自然環境生長的醇型廣藿香組培苗中百秋李醇含量呈遞增趨勢，但在240 d時仍低于外植體植株；廣藿香酮含量在150 d時最高，但總體呈下降趨勢，在240 d時與外植體植株相比無顯著差異；在30～210 d，廣藿香酮含量均高于百秋李醇；外界生長210 d時，百秋李醇含量高于廣藿香酮，表現出醇型化學型特征，見圖2B。

2.5 酮型廣藿香組培苗指標成分動態變化 隨著生長時間延長，酮型廣藿香瓶內生長組培苗中百秋李醇含量在0.013～0.022 mg/g范圍內波動，變化不大，而廣藿香酮含量逐漸增加，在240 d后更明顯；在30～330 d，廣藿香酮含量均高于百秋李醇，一直呈現酮型化學型特征，見圖3A。

移栽自然環境生長的酮型廣藿香組培苗中百秋李醇含量在210 d后升高，但在270 d時仍低于外植體植株；廣藿香酮含量總體呈增加趨勢，在270 d時與外植體植株相比無顯著差異；在30～270 d，廣藿香酮含量均高于百秋李醇，見圖3B。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。與百秋李醇比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 醇型廣藿香組培苗指標成分含量動態變化Fig.2 Dynamic changes of index components in tissue culture seedlings of patchoulol-type P.cablin

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。與百秋李醇比較，**P<0.01。圖3 酮型廣藿香組培苗指標成分含量動態變化Fig.3 Dynamic changes of index components in tissue culture seedlings of pogostone-type P.cablin

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。與瓶外苗比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 2種化學型組培苗指標成分比較Fig.4 Comparison of index components between two chemotypes tissue culture seedlings

2.6 瓶內生長、移栽自然環境生長的比較 在相同生長時間段，2種化學型廣藿香瓶外苗中百秋李醇含量均高于瓶內苗,見圖4A。醇型廣藿香瓶外苗的廣藿香酮含量低于瓶內苗；酮型廣藿香瓶外苗的廣藿香酮含量在30～180 d時高于瓶內苗，但在210～240 d時低于后者；在瓶內外生長前期醇型組培苗中廣藿香酮含量高于酮型組，但隨著生長時間延長逐漸降低，在240 d時低于酮型,見圖4B。

3 討論

本實驗發現，在瓶內生長的醇型廣藿香組培苗中百秋李醇含量低于廣藿香酮，而移栽自然環境生長后前者逐漸升高，后者逐漸降低，在210 d時逆轉；而酮型廣藿香組培苗無論在培養瓶中生長還是移栽至外界生長，廣藿香酮含量均高于百秋李醇，表明它在30 d叢生芽階段就呈現出廣藿香酮高百秋李醇低的化學型特點。He[8]發現，廣藿香是從黃芩亞科分支分化；不同化學型廣藿香的葉綠體基因組完全相同，只存在1個堿基的差異[9-10]。由于植物葉綠體基因組高度保守，2種化學型廣藿香葉綠體堿基差異的形成很有可能發生在傳入我國之前，地理距離在廣藿香的遺傳分化中的作用不明顯[11]，種質不同是化學型差異出現的主導因素，而遺傳學因素是廣藿香化學型差異形成的主導因素[4]。

廣藿香酮生物合成增加與相關基因的啟動子區域去甲基化有關[12]。在醇型廣藿香中，百秋李醇與廣藿香酮呈負相關，可能是百秋李醇和廣藿香酮的生物合成途徑競爭共同的前體[13-14]。醇型瓶內苗由于甲基化水平較低，故廣藿香酮含量較高，但移栽自然環境生長后光照等環境因子可能導致相關基因甲基化，隨著其水平增加，該成分含量逐漸降低，而與廣藿香酮合成相關基因表達的減少反而對百秋李醇合成有促進作用，故兩者出現此消彼長的現象。

酮型化學型特征的形成除了與5′-CCGG位點胞嘧啶甲基化有關外，可能還與其它位點甲基化或非編碼RNA等可遺傳的表觀變異有關[15]。推測酮型組培苗的甲基化水平低于醇型，而且前者可能缺少需要光照等啟動的必要元件，致使相關基因的啟動子區未能甲基化，因此移栽前后酮型組培苗一直呈現酮型化學型特征。“牌香”與高要蓮塘產廣藿香(酮型)中廣藿香酮含量較高，而“湛香”“南香”(醇型)中百秋李醇、α-愈創木烯等倍半萜類成分含量較高[16]，即2種化學型廣藿香化學成分種類和含量存在明顯差異。