多重連接探針擴增結合熔解曲線法鑒別南、北板藍根摻雜

李小芳， 王文斌， 莫 靜， 定天明,3， 謝 云*， 汪 波

(1.湖北中醫藥大學藥學院，湖北 武漢 430065；2.湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062；3.湖北省藥品監督檢驗研究院，國家藥品監督管理局中藥質量控制重點實驗室，湖北 武漢 430075)

板藍根(習稱北板藍根)為十字花科植物菘藍IsatisindigoticaFort.的干燥根[1]，南板藍根為爵床科植物馬藍Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek. 的干燥根莖及根[2]，均有清熱解毒、涼血、利咽等功效[3]，自1995年版《中國藥典》開始，兩者作為2個品種分別被收載[4]。南、北板藍根來源于親緣關系相對較遠的2個科，其成分不盡相同，功能主治必然有差別[5]。南板藍根中具有抗病毒活性的吲哚苷含量為北板藍根的2倍；靛玉紅對治療慢性粒細胞白血病有療效，它在南板藍根中的含量遠高于北板藍根；北板藍根利咽作用強于南板藍根[6]。

目前，通過性狀來鑒別南、北板藍根的真偽不夠客觀準確[7]。于英君[8]等采用RAPD 技術建立了南、北板藍根DNA指紋圖譜，對兩者進行了遺傳差異性分析；孫稚穎[9]等報道了南、北板藍根的 ITS2序列；黃志海[7]等利用ITS2條形碼技術實現了對南、北板藍根的區分鑒定，但關于兩者混合物中的摻偽情況尚未見報道。

多重連接依賴性探針擴增技術是一種在單一反應管內同時對50個不同靶基因進行定性和半定量分析的核酸檢測技術[10]，利用MLPA探針與靶序列雜交，通過連接酶進行探針的特異性連接，再用一對通用引物進行PCR擴增，利用毛細管電泳進行分離分析[11]，具有高通量、高特異性、檢測速度快、操作簡便等特點，在病原微生物的檢測[10, 12]、腫瘤和遺傳性疾病[13-15]的診斷、中藥材真偽鑒定[16]等領域已有廣泛應用。

本實驗基于ITS2特異區差異，設計2對MLPA探針，在傳統MLPA技術的基礎上再結合熔解曲線，建立了一種快速準確鑒別南、北板藍根的方法，可為兩者質量控制提供參考。

1 材料

1.1 藥材 北板藍根來自安徽阜陽、河北安國、重慶南川等地，南板藍根來自成都荷花池、海南興隆、重慶、廣西南寧等地，經湖北省藥品監督檢驗研究院中藥檢驗研究中心肖凌博士鑒定為正品，保存于湖北省藥品監督檢驗研究院，具體信息見表1。北板藍根(批號121367-201403)、南板藍根(批號120971-201507)對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.2 試劑與儀器 植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-03,天根生化科技有限公司)；金牌Mix(green)(TSE101，北京擎科生物科技有限公司)；DNA產物純化試劑盒(D1300, 北京索萊寶科技有限公司)；9°NTMDNA Ligase(M0238S, 北京擎科生物科技有限公司)；2×TSINGKE? Master qPCR Mix-SYBR(+UDG)(TSE203, 北京擎科生物科技有限公司)；DL1000 DNA Marker(日本TaKaRa公司)；瓊脂糖(182215，西班牙Biowest公司)。引物、MLPA 探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

MS204S萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；75002420冷凍高速離心機、Nanodrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo Fisher公司)；PCR 擴增儀(美國Bio-Rad公司)；MyGo Mini(美國Life Technologies公司)；Syergyuv超純水系統(美國Millipore公司)； MX-RL-E旋轉混懸儀[大龍興創實驗儀器(北京)股份公司]；DYY-10C電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；Gel Doc XR+凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；UF55干燥箱(德國美墨爾特公司)；移液器(德國艾本德公司)。

2 方法

2.1 探針設計及合成 從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中下載南板藍根和北板藍根的ITS2序列，導入MEGA6軟件篩選主導單倍型并進行比對，見圖1。找到其特異性識別區 “CAAGG”“CAAAG”，然后在上下游各截取適宜長度設計MLPA探針對。使用UNAfold(http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php)網站評價探針質量，BLAST搜索評估探針的特異性，RAW程序預測探針序列的長度、GC含量和Tm值。設計好的探針交由上海生工生物工程股份有限公司合成，新合成的探針為干粉狀態，使用前在冷凍高速離心機中12 000 r/min離心30 min，再根據離心管上的標示量，加入一定體積的TE緩沖液使其成為濃度為10 μmol/L的貯備液，使用時再稀釋成1 μmol/L。探針信息見表2。

圖1 ITS2序列Fig.1 ITS2 sequences

表2 MLPA雜交探針序列Tab.2 HybProbe sequences for MPLA

2.2 模板DNA制備 取干燥植物至滅菌的2 mL離心管中，加入小鋼珠2個，球磨儀磨成極細粉。取對照藥材、樣品粉末各50～80 mg, 采用植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，超微量分光光度計檢測DNA濃度和純度，選取質量較好者進行ITS2序列擴增，其擴增所用引物為通用引物ITS2F(5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′)、ITS3R(5′-GACGCTTCTCCAGACTACAA-3′)。擴增產物經電泳后在凝膠成像儀上檢視，取條帶明亮、擴增條帶長度符合預期大小者，一部分由上海生工生物工程股份有限公司進行測序，另一部分用DNA產物純化試劑盒按操作步驟進行純化(質量濃度50～200 ng/μL)，在-20 ℃下保存，后續進行MLPA-熔解反應。

2.3 MLPA-熔解反應 MLPA反應包括雜交、連接、實時熒光擴增、熔解過程。

2.3.1 DNA變性及雜交 取模板DNA 1 μL、預先充分混合探針1.5 μL、TE緩沖液5.5 μL，混勻，置于PCR儀中，在98 ℃下變形5 min，在70 ℃下雜交20 min，降溫至45 ℃后取出，連接反應。取1.28 μL DNA雜交產物，加入6.72 μL 9°N DNA ligase連接酶混合物形成8 μL體系，在45 ℃下連接左右探針15 min，在98 ℃下加熱5 min使連接酶失活。9°N DNA ligase連接酶混合物包括9°N DNA ligase buffer 0.8 μL、9°N DNA ligase 0.32 μL、ddH2O 5.6 μL。

2.3.2 熒光定量PCR擴增 取5 μL冷卻后的連接產物，加入2×T5 Fast qPCR Mix 10 μL、正向通用引物0.8 μL(5′-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3′)、反向通用引物0.8 μL(5′-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3′)、50×ROX Reference Dye Ⅰ 0.4 μL，ddH2O 3 μL。擴增程序為95 ℃ 預變性60 s，95 ℃ 變性10 s，60 ℃ 連接5 s，72 ℃ 延伸15 s，擴增38個循環，72 ℃延伸5 min；熔解曲線程序為95 ℃變性3 min；熒光采集溫度45～97 ℃，升溫速率0.05 ℃/s，采用MyGo Mini PCR Software 軟件分析特征熔解曲線圖譜。

3 結果

3.1 探針特異性試驗 單一探針特異性試驗結果見圖2A，混合探針特異性試驗結果見圖2B。由圖2A可知，南、北板藍根對照藥材的模板DNA與其對應單一探針進行MLPA-熔解曲線反應時，分別產生84.98、83.35 ℃的熔解曲線峰；取北板藍根探針與南板藍根模板DNA、南板藍根探針與北板藍根模板DNA、不加模板DNA進行試驗時，均無熔解曲線峰產生。由圖2B可知，南、北板藍根模板DNA分別與混合探針進行試驗時，產生85.26、83.58 ℃的熔解曲線峰。探針特異性試驗說明MLPA探針特異性良好，2個物種的模板DNA分別只與其對應的MLPA探針雜交，與其他物種沒有交叉反應，而且探針混合后未影響其特異性。

圖2 探針特異性試驗熔解曲線Fig.2 Melting curves for probe specificity tests

3.2 敏感性試驗 如圖3所示，當北板藍根(圖3A)模板DNA質量為187.0、97.7、47.9、19.9、14.0、7.3、5.3、3.4、1.2、0.72 ng，南板藍根(圖3B)模板DNA質量為151.5、58.0、29.9、15.5、7.5、4.5、2.9、1.4、0.7 ng時，能產生相應的熔解曲線峰；當兩者質量降低到0.1 ng時，信號峰響應很弱，熔解曲線峰接近于基線。

圖3 敏感性試驗熔解曲線Fig.3 Melting curves for sensitivity tests

3.3 混合樣品試驗 如圖4所示，當南板藍根比例為90%～5%時，可觀察到熔解曲線雙峰；將南板藍根的比例降至3%及3%以下，或北板藍根的比例降至5%及5%以下時，則檢測到單一的熔解曲線峰；當混合樣品中南板藍根所占比例不低于5%，或北板藍根所占比例不低于10%時可進行鑒別。

圖4 混合樣品試驗熔解曲線圖譜Fig.4 Melting curves for mixed sample tests

3.4 適用性試驗 對26批藥材進行MLPA-熔解曲線反應，將其DNA測序結果與NCBI數據庫中的序列比對，確認其基原。結果，有12批出現(83.53±0.60)℃的熔解曲線峰，14批出現(85.10±0.60)℃的熔解曲線峰，即前者為北板藍根，后者為南板藍根，與測序結果一致。

4 討論

基原、性狀、顯微和理化鑒定作為常規中藥鑒定方法，在中藥質量控制方面發揮了重要作用[17]。分子生物學技術在中藥鑒定領域得到廣泛應用，如DNA條形碼[18]、RAPD[19]、ISSR、MLPA[4,16-17]等技術憑借其準確度高、重復性好等優點受到研究者的青睞，但無法對混合樣品進行鑒定。本研究利用MLPA技術結合熔解曲線，建立了一種新的快速鑒別南、北板藍根的方法。

MLPA-熔解曲線法在于設計與目標靶序列高度特異的探針，當探針特異性序列與靶序列完全互補，連接酶才能將兩段探針連接成為一段完整的序列[20]，后續反應才能進行。每組探針只能與特定的藥材模板DNA雜交，產生對應的熔解曲線峰，相互之間不受干擾。靈敏度試驗中，隨著南、北板藍根模板DNA濃度不斷降低，0.7 ng依舊可以產生特異性熔解峰。此外，該方法操作簡單且效率高，在模板DNA準備好的情況下，使用MyGo Mini 熒光定量PCR儀，只需2～3 h便可完成至少16批樣品的檢測[21]。采用ITS2序列為擴增片段，其實際參與雜交的序列約60 bp，序列較短，而且在基因組內為多拷貝，降低了擴增和測序的難度，保證了探針合成的數量和質量，并且對于模板DNA的完整性要求不高，能避免因DNA降解對實驗產生的影響。

綜上所述，MLPA-熔解曲線法具有檢測速度快、靈敏度高、易于操作、成本低且無污染等特點，可為南、北板藍根的鑒別體系提供可靠的參考依據。