毛蕊花糖苷在常氧、缺氧大鼠體內(nèi)藥動學的比較

王維剛， 李曉琳， 燕 娜， 劉天龍， 王 芃， 郭姿良,， 吳 迪,5，李茂星,,5*

(1.聯(lián)勤保障部隊第九四○醫(yī)院臨床藥學科，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省高原藥學行業(yè)技術中心，甘肅 蘭州 730050；4.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730030；5.寧夏醫(yī)科大學藥學院，寧夏 銀川 750004)

高原環(huán)境具有低壓、低溫、缺氧等特點[1]，其中缺氧是影響生命活動及疾病發(fā)展的重要因素之一，此時機體產(chǎn)生過度氧化應激，引發(fā)炎癥反應、細胞凋亡、能量代謝紊亂等，導致腦肺損傷、記憶下降，加重運動疲勞，降低高原作業(yè)效能[2-4]。

毛蕊花糖苷是肉蓯蓉、熟地黃、車前子等藥用植物的指標成分[5-6]，它不僅可減輕腦組織損傷，而且具有良好的抗疲勞活性[7-8]；在體內(nèi)外模擬腸道條件下可通過糖苷鍵及酯鍵斷裂，分解為羥基酪醇和咖啡酸[9-10]；灌胃給藥后吸收迅速，分布廣泛，生物利用度良好[11]；尾靜脈注射給藥后可快速代謝產(chǎn)生羥基酪醇，并且后者在體內(nèi)可被快速代謝和消除[12]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊花糖苷、羥基酪醇、咖啡酸均具有良好的體外抗氧化活性，而且前兩者還能改善PC12細胞缺氧損傷，表明毛蕊花糖苷口服給藥后可能是原藥與其代謝產(chǎn)物羥基酪醇、咖啡酸協(xié)同發(fā)揮作用。本實驗比較了毛蕊花糖苷在常氧、缺氧大鼠體內(nèi)藥動學，以期為該成分后續(xù)研究提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 毛蕊花糖苷原料藥(純度≥94%，自制)；毛蕊花糖苷(純度≥98%，批號PS000683)、羥基酪醇(純度≥98%，批號PRF10100843)、咖啡酸(純度≥98%，批號102913)、染料木素(純度≥98%，批號PRF9112103)對照品(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司)。色譜純乙腈(瑞典Oceanpak公司，批號20100310G202)；色譜純甲酸(批號xk-011-00017)、乙酸乙酯(批號2020102201)(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)；水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀、Agilent 6560離子淌度飛行時間質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；FLYDWC50-ⅡC低壓低氧動物實驗艙(貴州風雷航空軍械有限公司)；JPXH-D可調(diào)式渦旋混勻器(上海旌派儀器有限公司)；3K15高速冷凍離心機(美國Sigma公司)；BP210S電子天平(德國賽多利斯公司)RUC-2-25離心濃縮儀(德國Labconco公司)。

1.3 動物 SPF級Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，購自中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四○醫(yī)院動物實驗科，動物使用許可證號SYXK(軍)2017-0046，飼養(yǎng)室溫度(25±2)℃，相對濕度40%～60%，標準飼料喂養(yǎng)，自由進水。實驗經(jīng)聯(lián)勤保障部隊第九四○醫(yī)院動物倫理委員會批準(審批編號2020KYLL121)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-QTOF-MS分析條件

2.1.1 色譜 Thermo Hypersi1 GOLD色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；Thermo嵌入式保護柱套(2 mm)；Thermo Hypersil GOLD保護柱柱芯(2.1 mm×0.2 μm)；流動相乙腈(A)-水(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.4 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長281 nm；進樣量2 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.1.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI)；干燥器溫度225 ℃，體積流量7.0 L/min；霧化器壓力25 psi(1 psi=6.895 kPa)；鞘氣(N2)溫度325 ℃，體積流量12.0 L/min；毛細管電壓4 000 V；噴嘴電壓1 000 V；負離子檢測模式，m/z100～750；提取離子羥基酪醇m/z153.055 7，咖啡酸m/z179.035 0，毛蕊花糖苷m/z623.198 1，內(nèi)標(染料木素)m/z269.048 8，各成分全掃描質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 各成分全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Full scan MS spectra for various constituents

2.2 溶液制備

2.2.1 給藥液 稱取毛蕊花糖苷原料藥適量，滅菌注射用水溶解，即得(質(zhì)量濃度為30 mg/mL)。

2.2.2 對照品、內(nèi)標溶液 精密稱取毛蕊花糖苷、羥基酪醇、咖啡酸對照品0.002 0 g，置于10 mL棕色量瓶中，乙腈超聲溶解后加水定容，即得對照品溶液(質(zhì)量濃度均為200 μg/mL)。精密稱取染料木素對照品0.002 0 g，同法制備內(nèi)標溶液。

2.2.3 血漿標準曲線樣品、質(zhì)控樣品溶液 將“2.2.2”項下對照品溶液用50%乙腈依次稀釋至100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000 ng/mL，分別吸取5 μL至EP管中，加入45 μL空白血漿，渦旋混勻1 min，即得血漿標準曲線樣品溶液(質(zhì)量濃度為10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 ng/mL)。同法制備毛蕊花糖苷、羥基酪醇、咖啡酸質(zhì)量濃度分別為20、100、500 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液。

2.3 血漿處理 大鼠血漿4 000 r/min離心10 min，取上清50 μL，加入乙酸乙酯400 μL、內(nèi)標溶液(4 μg/mL)2 μL，渦旋10 min，12 000 r/min離心15 min，取乙酸乙酯層至1.5 mL離心管中，萃取2次，37 ℃離心濃縮儀上揮干，50 μL 5%乙腈復溶，15 000 r/min離心5 min，取上清液，進行HPLC-QTOF-MS分析。

2.4 建模、給藥與采血

2.4.1 常氧大鼠 將7只大鼠編號并稱定質(zhì)量，每只按300 mg/kg劑量灌胃給予“2.2.1”項下給藥液。大鼠給藥前12 h禁食，自由飲水，于給藥前和給藥后5、10、15、30、45 min及1、1.5、2、4、6、8、12、24 h眼眶靜脈采集全血各0.3 mL，置于肝素化EP管中，在-20 ℃下保存，按“2.3”項下方法處理，進行HPLC-QTOF-MS分析。

2.4.2 缺氧大鼠 將7只大鼠編號后置于低壓低氧動物實驗艙中，在模擬高原7 500 m下缺氧暴露3 d，制備缺氧模型。大鼠給藥前12 h禁食，自由飲水，稱定質(zhì)量后每只按300 mg/kg劑量灌胃給予“2.2.1”項下給藥液，于給藥前和給藥后5、10、15、30、45 min及1、1.5、2、4、6、8、12、24 h眼眶靜脈采集全血各0.3 mL，置于肝素化EP管中，在-20 ℃下保存，按“2.3”項下方法處理，進行HPLC-QTOF-MS分析。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性試驗 取6個來源大鼠空白血漿適量，加入“2.2.2”項下對照品(20 ng/mL)、內(nèi)標溶液，按“2.3”項下方法處理，在“1.4”項條件下進樣測定，結(jié)果見圖2，可知該方法專屬性良好。

2.6.2 線性關系考察 取“2.2.3”項下血漿標準曲線樣品溶液適量，按“2.3”項下方法處理，在“1.4”項條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，對照品與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標(Y)進行回歸，并以S/N=10為定量限，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6.3 精密度、準確度試驗 取“2.2.3”項下血漿標準曲線樣品溶液適量，按“2.3”項下方法處理，在“1.4”項條件下進樣測定，同一天內(nèi)連續(xù)進行6次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)進行3 d，每天1次，計算日間精密度，并考察方法準確度，結(jié)果見表3。由此可知，各成分日內(nèi)、日間精密度RSD均小于12%，準確度均在94.89～111.52%范圍內(nèi)，符合生物樣品分析要求。

表3 各成分準確度、精密度試驗結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of accuracy and precision tests for various constituents(n=6)

注：a～e分別為總離子流圖及羥基酪醇、咖啡酸、染料木素、毛蕊花糖苷提取離子流圖。圖2 各成分HPLC-QTOF色譜圖Fig.2 HPLC-QTOF chromatograms of various constituents

2.6.4 提取回收率、基質(zhì)效應試驗 取“2.2.3”項下血漿標準曲線樣品溶液適量，每個質(zhì)量濃度6份，按“2.3”項下方法處理，在“1.4”項條件下進樣測定，得峰面積A1；另取空白血漿，按“2.3”項下方法處理，濃縮儀揮干后殘渣分別用20、100、500 ng/mL對照品溶液復溶，在“1.4”項條件下進樣測定，得峰面積A2；取20、100、500 ng/mL對照品溶液適量，在“1.4”項條件下進樣測定，得峰面積A3，以A1與A2的比值計算提取回收率，A2與A3的比值計算基質(zhì)效應，結(jié)果見表4。由此可知，該方法下毛蕊花糖苷、咖啡酸提取回收率、基質(zhì)效應均在85%以上，而羥基酪醇更達到90%以上。

表4 各成分提取回收率、基質(zhì)效應試驗結(jié)果Tab.4 Results of extraction recovery rate and matrix effect tests for various

2.6.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項下血漿標準曲線樣品溶液適量，每個質(zhì)量濃度5份，按“2.3”項下方法處理，分別于室溫[(21±2)℃]下放置6 h、4 ℃下放置6 h，-20 ℃下保存7 d、-20 ℃下凍融3次后在“1.4”項條件下進樣測定，結(jié)果見表5。由此可知，在上述條件下各成分峰面積RSD均小于10%，表明血漿穩(wěn)定性良好。

表5 各成分穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=5)Tab.5 Results of stability tests for various constituents(n=5)

2.7 體內(nèi)藥動學研究 在常氧、缺氧大鼠血漿中均未檢測到羥基酪醇，毛蕊花糖苷、咖啡酸主要藥動學參數(shù)見表6，血藥濃度-時間曲線見圖3～4。由此可知，與常氧大鼠血漿比較，缺氧大鼠血漿中毛蕊花糖苷AUC0～t、AUC0～∞、Cmax降低(P<0.05)，Tmax、Vz/F升高(P<0.05)；咖啡酸AUC0～t、AUC0～∞、Cmax降低(P<0.05)，MRT0～∞、Tmax、Vz/F升高(P<0.05)。

表6 毛蕊花糖苷、咖啡酸主要藥動學參數(shù)Tab.6 Main pharmacokinetic parameters for verbascoside and caffeic

圖3 毛蕊花糖苷血藥濃度-時間曲線Fig.3 Plasma concentration-time curves for verbascoside

圖4 咖啡酸血藥濃度-時間曲線Fig.4 Plasma concentration-time curves for caffeic acid

3 討論

課題組前期發(fā)現(xiàn)，灌胃給予大鼠300 mg/kg毛蕊花糖苷后呈現(xiàn)出良好的抗缺氧、抗疲勞活性[7-8]。因此，為了進一步探究毛蕊花糖苷藥效基礎，本實驗也選擇300 mg/kg作為給藥劑量。

高原低氧對機體的物質(zhì)代謝系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等均有顯著影響，從而影響藥動學過程[13-16]。本實驗在常氧、缺氧大鼠體內(nèi)檢測到了毛蕊花糖苷和咖啡酸，但未發(fā)現(xiàn)羥基酪醇。在體內(nèi)胃腸道及體外模擬消化條件下，毛蕊花糖苷水解生成羥基酪醇[9-10]；靜脈注射給予毛蕊花糖苷后，在血漿中可檢測到羥基酪醇[12]，而且在肝臟中快速轉(zhuǎn)化為次級代謝產(chǎn)物[17]，故推測羥基酪醇可能被肝臟快速代謝，使血漿中其濃度低于檢測限。

與常氧大鼠比較，缺氧大鼠血漿中毛蕊花糖苷AUC0～t、AUC0～∞、Cmax分別降低50%、48%、55%，Tmax增加114%，表明毛蕊花糖苷吸收強度降低一半左右，吸收速度減慢。缺氧可導致Caco-2細胞P-gp表達上調(diào)，使藥物外排增多，減少藥物吸收，導致芍藥苷、左氧氟沙星、甲硝唑吸收降低[10,18-20]，推測缺氧大鼠毛蕊花糖苷吸收減弱的原因一方面可能與大鼠小腸外排蛋白P-gp表達上調(diào)、外排作用增強有關，從而降低小腸對藥物的吸收[18]，而另一方面缺氧可導致大鼠胃排空作用減弱[21]；Vz/F顯著升高，可能是AUC、Cmax降低的原因，并且課題組前期發(fā)現(xiàn)，毛蕊花糖苷與缺氧大鼠血漿蛋白結(jié)合率降低，導致該成分更容易向組織中分布，可能導致該參數(shù)升高。另外，缺氧大鼠血漿中咖啡酸AUC、Cmax顯著降低，Tmax顯著延長，提示該成分體存量減少，其原因可能與P-gp表達上調(diào)及減緩胃排空有關，也可能與代謝生成速率減慢有關；Tmax、Vz/F、t1/2z、MRT0～∞顯著增加，提示缺氧狀態(tài)下該成分在大鼠體內(nèi)代謝減慢，平均駐留時間延長，組織分布增加。

綜上所述，毛蕊花糖苷在缺氧大鼠體內(nèi)藥動學發(fā)生明顯變化；缺氧損傷后，毛蕊花糖苷及其代謝產(chǎn)物咖啡酸組織分布增加，但吸收減弱，體存量減少，在一定程度上制約了藥效發(fā)揮。因此，在實際抗缺氧用藥過程中應增加毛蕊花糖苷劑量，以期保證其藥效基礎。