廣西斑地錦及其混淆品DNA 條形碼分子鑒定

侯 靜，黃 勇，黎 理，王素娥，蔡 毅

（廣西中醫藥大學，南寧 530001）

斑地錦（Euphorbia maculataL.）是大戟科（Euphorbiaceae）大戟屬（Euphorbia）地錦草組藥用植物，有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃等功效；可用于治療痢疾、泄瀉、尿血、崩漏、瘡癤癰腫、濕熱黃疸等疾病［1］。近年來研究發現，其也具有保肝、治療宮頸癌、抗腫瘤、抗高血糖、抑制胃癌細胞增殖、抗骨質疏松及抗細胞毒性等藥理作用［2-14］。地錦草組植物有10 種［15］，分布在廣西的有6 種，其中斑地錦、匍匐大戟（Euphorbia prostrataAit.）、臺西地錦［Euphorbia taihsiensis（Chaw et Koutnik）Oudejians.］、千 根 草（Euphorbia thymifoliaL.）這幾種較為常見且常常混生，植物形態和藥材性狀也極為相似［16，17］，這就造成斑地錦鑒別困難，從而無法準確確定其來源。本研究采用DNA 條形碼技術對廣西產斑地錦及混淆品進行鑒別，有助于提高斑地錦臨床用藥的準確性，同時為地錦草組植物的鑒別提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗儀器和試劑 儀器：ES2220M 型電子天平（普利賽斯公司），Milli-Q Biocel 型純水儀（Millipore 公司），DYY-6C 型電泳儀（北京六一生物科技有限 公司），Thermal Cycler-T100 型梯 度PCR 儀（BIORAD 公司），H1650-W 型高速離心機（湘儀公司），GelDoc XR+型全自動凝膠成像系統（BIORAD公司），HWS-24 型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司），TGem Plus 型超微量分光光度計（天根生化科技（北京）有限公司）。試劑：2×Reaction Mix 緩沖液、D2000 DNA Marker、DNase/RNase-Free Deionized Water（TIAN GEM 公 司）；GelGreen（41003，Biotium）；1 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）、0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）、6×DNA Loading Buffer（Solarbio）、氯化鈉（西隴科學股份有限公司）、瓊脂糖（博格林生物）、無水乙醇、異丙醇、氯仿（分析純，天津市富宇精細化工有限公司）、CTAB（美侖生物科技有限公司）。

1.1.2 樣品 采自廣西壯族自治區的斑地錦及其混淆品樣品共41 份，經鑒定為大戟科大戟屬斑地錦、匍匐大戟、臺西地錦及千根草，樣品具體信息如表1所示。

表1 斑地錦及其混淆品的樣品信息

1.2 試驗方法

1.2.1 提取DNA 取100 mg 斑地錦及混淆品樣品地上部分置于研缽中加液氮迅速研磨成粉末，將其轉入已滅菌的2 mL 離心管中，加入750 μL 預熱的DNA 提取緩沖液［2% CTAB，2% β 巰基乙醇，100 nmol/L Tris-HCl（pH 8.0），20 nmol/L EDTA（pH 8.0），1.4 mol/L NaCl，2% PVPK 40］搖勻。65 ℃水浴1 h，每隔10 min 振蕩1 次。取出后加入預冷的650 μL 氯仿-異戊醇（24∶1）振蕩搖勻，1 200 r/min，離心10 min后取上清液轉入1.5 mL 滅菌離心管中，加入2/3 體積預冷的異丙醇，上下顛倒搖勻。于-20 ℃下沉淀1～2 h，1 200 r/min，離心5 min 后去廢液。750 μL 無水乙醇洗2 次，自然風干。加入50～80 μL TE 緩沖液溶解DNA，-20 ℃條件下保存。

1.2.2 PCR 擴增及測序 PCR 反應體系為25 μL，其 中2×Reaction Mix 12.5 μL，Golden DNA Polymerase 0.2 μL，模板DNA 2 μL，正向反向引物各1 μL，滅菌ddH2O 8.3 μL。rbcL 和psbA-trnH 引物均由睿博興科生物技術有限公司合成（表2）。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，退火1 min（rbcL 退火溫度為52 ℃，psbA-trnH 為51 ℃），72 ℃延伸1 min，35 次循環，末次循環后72 ℃延伸5 min。將獲得的單一明亮條帶的PCR 產物送至廣州華大基因公司進行雙向測序。

表2 rbcL 和psbA-trnH 引物

1.2.3 數據處理 利用GenBank 數據庫Blast 檢測所測序列的準確性和方向性，利用BioEdit 對序列進行人工校正［18］，去除引物片段。此外，從GenBank 獲取了13 份斑地錦及其混淆品的rbcL 和psbA-trnH序列用于后續的分析（表3）。利用MEGA 7.0 對所有材料rbcL 和psbA-trnH 序列的變異位點進行分析［19］，基于K2P 模型計算種內和種間遺傳距離，利用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建斑地錦及混淆品的系統發育樹，利用bootstrap（1 000 次重復）檢驗各分支的支持率。

表3 斑地錦及其混淆品樣品GenBank 序列號

2 結果與分析

2.1 rbcL 和psbA-trnH 序列特征

由表4 可知，所有品種的rbcL 序列長度均為548 bp，其中斑地錦種內存在3 個變異位點，斑地錦與匍匐大戟、臺西地錦、千根草的種間變異位點分別為5、5、4個；除土庫曼大戟外（不含psbA-trnH序列），其他品種的psbA-trnH 序列長度均為631 bp，斑地錦種內存在2 個變異位點，斑地錦與匍匐大戟、臺西地錦、千根草種間變異位點分別為13、17、14 個。

表4 斑地錦及其混淆品樣品的rbcL 和psbA-trnH 序列分析

2.2 種內及種間遺傳距離

通過MEGA7.0 軟件，基于K2P 模型對斑地錦樣品及其混淆品的種內和種間遺傳距離進行計算，結果見表5、表6。基于rbcL 序列分析的結果可以發現，斑地錦種內遺傳距離為0.000，明顯小于其與各個混淆品間的遺傳距離，其與臺西地錦的種間遺傳距離最大，為0.007；匍根大戟與土庫曼大戟以及與臺西地錦間的遺傳距離均為0.000。基于psbA-trnH遺傳距離分析結果可以發現，斑地錦與匍匐大戟、臺西地錦、千根草、地錦草、匍根大戟的種間遺傳距離分別為0.012、0.016、0.013、0.014、0.012。

表5 斑地錦與其混淆品樣品rbcL 序列的遺傳距離

表6 斑地錦與其混淆品樣品psbA-trnH 序列的遺傳距離

2.3 系統發育樹分析

以蓖麻（BM）作為外群，基于K2P 模型構建了斑地錦和混淆品樣品的rbcL 和psbA-trnH 序列系統發育樹，結果如圖1 所示。在系統發育樹中，斑地錦樣品及其混淆品各自形成單系且均有較高支持率，這表明rbcL 和psbA-trnH 序列均可用于斑地錦與其常見的混淆品鑒別。

圖1 斑地錦及混淆品的NJ 樹

3 小結與討論

在本研究中，基于rbcL 序列分析發現，匍根大戟和臺西地錦的種內及種間遺傳距離均為0.000，該基因片段無法將兩者區分開；基于psbA-trnH 序列發現兩者之間遺傳距離為0.003，可進行有效區分；在系統發育樹中，這2 種樣品形成一個大的分支，支持率為96%，表明兩者間親緣關系較近。rbcL、psbA-trnH 這2 個序列無法將同一品種不同來源的樣品進行區分，但基于rbcL 序列分析發現，采集于柳州市的斑地錦的種內遺傳距離為0.001，而采集于南寧市和桂林市的斑地錦種內遺傳距離均為0.000，表明來源于柳州市的斑地錦種內差異較大。

DNA 條形碼技術有種屬保守性，又有近緣物種的特異性［20，21］，線粒體psbA-trnH 序列是被子植物葉綠體基因組中變異位點最多的序列之一［22，23］，在藥材鑒定中有著較廣泛的應用，具有較好的植物種間鑒別作用。rbcL 可單獨或與其他基因片段組合用于植物種群的鑒定、分類等研究［24］。高節點支持率能在物種鑒定和計量系統發育多樣性時提供無偏差的估計，并獲得較為可信的結果［25，26］。本研究發現，rbcL 與psbA-trnH 組合構建的NJ 系統發育樹具有高節點支持率，分支聚類結果可信，可用于斑地錦與其常見混淆品的鑒別。僅使用葉綠體基因片段或核基因片段鑒定物種，鑒別成功率往往較低，而將基因片段進行組合構建系統發育樹則有利于提高物種DNA 條形碼鑒定效果［27］。