魚鰾膠原蛋白-殼聚糖-海藻酸鈉水凝膠促小鼠皮膚傷口愈合研究

李航婷，金明月，李諾營，莫奕雯，田 靜，楊最素

（浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316022）

皮膚是人體最大的感覺器官，工作中容易受到意外損傷，在傷口愈合時，需要上皮組織的再生、肉芽組織的形成、瘢痕組織生成等的復雜組合，膠原蛋白的沉積和血管形成是創傷愈合的關鍵。傳統傷口敷料主要是使用脫脂棉紗布等天然纖維材料，使傷口干燥及物理隔離功能等，但換藥時容易撕拉傷口，引起再出血等不利于愈合［1］。近年來，海洋膠原蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽的開發及用于傷口敷料的研究日益增多，而三者復合后制備的水凝膠更是被廣大學者所重視。海洋膠原蛋白具有低免疫性、高組織相容性、可降解性及創面止血等多種生物學性質；而殼聚糖是一種天然的正電荷的高分子多糖，具有良好的抗菌、防黏連、促愈合等功效；海藻酸鹽具有高吸水性、成膠性、止血性，與Ca2+交聯形成海藻酸鈉水凝膠，具有良好的生物相容性和較低的細胞毒性，可為傷口提供恒溫恒濕的理想環境［2］。

鰻魚（Anguillidae）肉質鮮美、營養價值高，除日常鮮食外，常被加工成鰻魚干、烤鰻魚片等，在加工過程中會產生大量的加工副產物。其中魚鰾除被少量食用外，大量魚鰾以廢棄物丟棄，浪費了資源，也污染了環境。研究表明，魚鰾中含有大量的膠原蛋白［3］，因此可提取鰻魚膠原蛋白制備具有高附加值的產品。濕潤、透氣、抗菌的微環境能促進細胞的增殖與遷移，有利于皮膚傷口的愈合［4］。本試驗以鰻魚魚鰾膠原蛋白為主藥，與Ca2+分別交聯的殼聚糖和海藻酸鈉為配料制備水凝膠，探討其對小鼠皮膚傷口的愈合作用，為鰻魚魚鰾的高附加值利用和傷口敷料開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 BSA124S 型電子天平（Sartorius AG 公司）；RLPHR 1-4LD 型冷凍干燥機（德國Christ 公司）；SEM3000S 型掃描電子顯微鏡（國儀量子技術有限公司）；CX31 型光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；SpectraMax M2 型多功能酶標儀（美國Molecular Devices 公司）。

1.1.2 藥品與試劑 新鮮鰻魚魚鰾（舟山市某菜場）；魚鰾膠原蛋白（浙江海洋大學食品與藥學學院自制）；卡波姆（上海麥克林生化科技有限公司）；海藻酸鈉（上海生工股份有限公司）、殼聚糖（濟南海得貝海洋生物工程有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染液、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MAD）、過氧化氫酶（CAT）、總抗氧化力（T-AOC）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（武漢伊萊瑞特有限公司）。

1.1.3 動物 ICR 雄性健康小鼠，體重22～24 g，購自浙江省杭州子源實驗動物科技有限公司（許可證號SCXK（浙）2019-0004），飼養于浙江海洋大學實驗動物房（許可證號：SYXK（浙）2019-0031）。

1.2 方法

1.2.1 鰻魚魚鰾膠原蛋白的提取 新鮮鰻魚魚鰾預處理后，脫脂，酸法提取條件為乙酸濃度0.5 mol/L、料液比（g/mL）1∶55，酸解處理20 h，透析后冷凍干燥即得酸溶性Ⅰ型膠原蛋白，置于-20 ℃儲存備用。

1.2.2 水凝膠的制備

1）凝膠液制備。魚鰾膠原蛋白0.20 g、卡波姆、海藻酸鈉、甘油，蒸餾水30 mL。0.60 g 海藻酸鈉加入蒸餾水室溫溶脹過夜，0.15 g 卡波姆加入蒸餾水和0.50 g 甘油加熱溶脹過夜，將所有物質在常溫混勻后置于4 ℃中2 h 脫泡處理，即得凝膠液。

2）交聯液制備。制備0.05 mol/L 的CaCl2溶液和0.01 g/mL 的殼聚糖溶液，將兩種溶液1∶1 混合均勻，即得交聯液，密封保存備用。

3）水凝膠交聯。將凝膠液倒入培養皿，均勻平鋪薄層即可，放入4 ℃冷存2 h 后取出，將交聯劑溶液倒入模具中，使之充分交聯后，即得魚鰾膠原蛋白-殼聚糖-海藻酸鈉水凝膠。取出水凝膠片，用蒸餾水沖洗干凈后備用。

1.2.3 水凝膠掃描電鏡檢測 將水凝膠樣品冷凍干燥后切割成7 mm 的直徑大小，在20 kV 加速電壓下，濺射鍍金250 s 后，在掃描電鏡下觀察其超微結構。使用Image J 和Origin Pro 2021 軟件（Origin Lab），每張圖像分析20 個隨機點，統計毛孔的平均直徑。

1.2.4 皮膚傷口愈合

1）皮膚傷口制作。24 只雄性ICR 小鼠適應性飼養一周后，隨機分為兩組即對照組和水凝膠組。各組小鼠應用4%的水合氯醛麻醉，剃去背毛，常規皮膚消毒，用無菌外科剪刀剪出1 cm 直徑的傷口區域。對照組傷口區域僅用0.9%生理鹽水處理，水凝膠組用水凝膠完全覆蓋，水凝膠在使用前用紫外線照射滅菌。試驗3、7 和14 d 時觀察傷口狀態并拍照，使用Image J 軟件計算傷口面積，傷口愈合率=（初始傷口面積-特定一天傷口面積）/初始傷口面積×100%。

2）血清抗氧化水平檢測。試驗3、7 和14 d，處死每組小鼠前進行摘眼球取血，4 ℃下5 000 r/min 離心5 min 收集血清，使用試劑盒說明書檢測MAD 含量和CAT、SOD、T-AOC、GSH-Px 活性。

3）血清炎癥因子檢測。利用試劑盒檢測IL-6、IL-1β 及TNF-α 含量。

4）皮膚HE 染色。試驗3、7 和14 d 時，處死小鼠后小心取下傷口區域皮膚，4%多聚甲醛固定24 h 后石蠟包埋，切片、脫蠟、水化、HE 染色后在光學顯微鏡下觀察皮膚傷口的組織學結構。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS23.0 軟件進行統計學分析。計量數據用x±S表示，組間比較采用單因素方差分析t檢驗，以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 水凝膠掃描電鏡

水凝膠掃描電鏡觀察如圖1 所示，水凝膠上具有高度互連多孔的結構，水凝膠分子之間相互交聯，形成連續密集的小孔，孔徑在1～175 μm 間，水凝膠的孔隙率為（84.00±5.46）%。

圖1 水凝膠的掃描電鏡結構

2.2 小鼠傷口愈合情況

小鼠皮膚傷口愈合如圖2A 所示，試驗3 d 時對照組皮膚傷口的紅腫、炎癥情況較為嚴重，水凝膠組的炎癥情況較為輕微并傷口開始縮小。試驗7 d 時對照組的傷口炎癥有所減輕，傷口開始縮小，而水凝膠組的傷口明顯縮小，炎癥反應消失。試驗14 d 后兩組小鼠傷口均顯示趨向愈合狀態，傷口周圍有細小的毛發長出，但對照組尚未完全愈合，且皮膚疤痕比水凝膠組的明顯。傷口愈合率結果如圖2B 所示，水凝膠組傷口愈合率明顯高于對照組。

圖2 小鼠傷口及傷口愈合率比較

2.3 血清抗氧化水平檢測結果

血清中5 個抗氧化指標的檢測結果如圖3 所示。試驗第3 天兩組小鼠的SOD、GSH-Px、CAT 和TAOC 4 個抗氧化指標最低。隨著試驗時間的延長，抗氧化水平逐漸提高，特別到第14 天時，水凝膠組抗氧化水平上升幅度更大，相比均具有統計學意義；而MDA 含量，對照組第3 天時均較高，第7 天時水凝膠組下降明顯。

圖3 小鼠血清抗氧化活性檢測

2.4 血清炎癥因子檢測結果

血清中炎癥因子的檢測結果如圖4 所示。對照組IL-1β 在試驗第3 天時較高，隨后逐漸下降；而水凝膠組的3 個時間段均低于對照組。對照組和水凝膠組IL-6 水平相差較大，后期均有不同程度的下降。TNF-α 水平在試驗第3 天時對照組稍高于水凝膠組，在第7 天、第14 天時顯著低于對照組。

圖4 小鼠血清炎癥因子的檢測

2.5 皮膚切口HE 染色結果

皮膚切口HE 染色結果如圖5 所示。試驗第3天時2 組皮膚切口最上方都有染成紅色的滲出物，對照組真皮及與皮下組織交界處的炎癥細胞浸潤更多。第7 天時對照組切口表面形成1～2 層的表皮細胞，真皮內有肉芽組織形成。水凝膠組已形成2～3層的表皮細胞，真皮內有肉芽組織形成；可見新生的皮脂腺、汗腺及導管。第14 天對照組切口表面形成2～3 層的表皮細胞，真皮內有大量的膠原纖維、少量的皮脂腺，汗腺及導管已形成。水凝膠組第14 天切口處已形成復層扁平上皮，可見基底層、棘層、顆粒層、透明層及少量的角質層，真皮與表皮間有明顯的乳頭層，網狀層結構致密，皮脂腺、汗腺及導管明顯增多。

圖5 皮膚切口HE 染色結果（×200）

3 小結與討論

隨著海洋生物醫藥的發展，以海藻酸鹽膜為基底膜，配以膠原蛋白和殼聚糖混合后制備的復合敷料已有報導，但所選取的膠原蛋白多來源于魚皮或魚鱗，前期處理比較麻煩［5，6］。已有報導從日本黃姑魚魚鰾中提取的膠原蛋白具有較好的抗氧化活性，減少出血與滲出，可促進皮膚傷口的愈合［7］，但有關以鰻魚魚鰾膠原蛋白為主藥復合材料制備的傷口敷料目前尚未見報導。

水凝膠敷料是一種新型的創傷敷料，是將水溶性的高分子材料或其單體經加工處理后，形成具有三重網狀結構且不溶于水的膠狀物質，而孔隙率和孔隙結構是設計水凝膠劑型的關鍵因素［8］。為檢測制備的水凝膠結構，通過掃描電鏡技術觀察制備的水凝膠是具有多孔隙的三維網絡結構，多孔的水凝膠有利于細胞的附著、增殖和遷移，利于新生皮膚組織的生長，因此本試驗制備的水凝膠材料是促進傷口愈合使用的理想材料。

在傷口愈合炎癥階段，炎癥細胞產生大量ROS［9，10］。過量的ROS 會導致細胞死亡和壞死，不利于傷口愈合，判斷氧化應激反應及清除自由基能力可檢測血液中的抗氧化指標。隨著試驗時間的延長，水凝膠組中SOD、GSH-Px、CAT 和T-AOC 的活性比對照組的更高；而MDA 是主要的脂質過氧化終產物，卻隨著時間的延長而含量逐漸降低，表明水凝膠能較好地清除體內自由基，增加過氧化物酶的活性，提高血清總抗氧化能力，減輕氧化應激反應。

皮膚創面愈合中伴隨著炎癥反應，是創面修復的起始環節，如何促進創傷愈合、減輕炎癥反應是醫藥界需要解決的難題［11］，也是傷口敷料是否合格的標志。研究表明，IL-1β、IL-6 和TNF-α 具有介導炎癥反應發生發展的生物學特性［7］，檢測血清中炎癥因子的變化可判斷炎癥的進展情況。結果表明，水凝膠組3 個炎癥因子指標均低于對照組，隨著時間的延長均有下降趨勢，特別是TNF-α 下降幅度最大，二者的差異更明顯，因此認為水凝膠可降低炎癥反應，促進皮膚傷口的愈合。傷口敷料是否有利于皮膚損傷后的修復，需要從組織形態學上進行觀察。試驗發現，水凝膠組的皮膚傷口炎癥、滲出明顯減輕，肉芽組織的形成、表皮、真皮及附屬器官的再生明顯早于對照組，表明制備的水凝膠能減輕傷口的炎癥反應，促進皮膚再生，有利于傷口的修復。

本試驗應用酸法制備的鰻魚魚鰾膠原蛋白，復合殼聚糖-海藻酸鈉交聯后獲得的水凝膠是個多孔隙結構，可為傷口修復提供濕潤的接觸環境，并吸收創口中的滲出液、防止二次損傷等優點，水凝膠能提高抗氧化能力，降低血清中的炎癥因子，促進小鼠皮膚傷口愈合，是一種具有開發潛力的傷口敷料。