基于兩面針新棒狀花椒酰胺含量的動態累積研究

黃光偉 黃 靜 梁雪松 李月菲

(柳州兩面針股份有限公司，廣西 柳州 545006)

兩面針是廣西的優勢道地藥材之一。兩面針具有解毒消腫、氣止痛、活血化瘀、祛風通絡等作用，廣泛應用于中醫處方、中成藥及日化產品中，它的提取物是兩面針中藥牙膏的主要功效物質，藥用部位為蕓香科植物兩面針Zanthoaylum nitidum(Roxb．)DC．的干燥根[1]。兩面針藥材及其相關產品已成為振興廣西經濟的特色產業之一。

長期以來，國內外學者對兩面針的本草考證、生藥學、化學成分、藥理作用、臨床應用等方面進行了較全面的研究[2]。研究表明，兩面針藥材中的化學成分較復雜，其莖皮、根和根皮中含有生物堿類、木脂素類、黃酮類、甾醇類等多種化合物，其中生物堿是兩面針主要的化學成分之一。2005年，劉紹華博士進行了“兩面針鎮痛、抗炎和止血活性成分的研究和應用”的研究，研究發現，在兩面針藥材中，除了生物堿類具有生物學活性外，其中的新棒狀花椒酰胺也具有顯著的鎮痛、抗炎和止血生物學活性[3]。

對于兩面針不同生長期和不同部位的活性成分含量，已有文獻報道[4-6]，但絕大多數是以氯化兩面針堿作為評價指標成分，且沒有足夠的時間跨度進行系統研究。本研究利用我公司擁有兩面針GAP種植研究基地種植的藥材在時間跨度上超過10年以上的便利條件，對不同年份、同年而不同月份的兩面針藥材，采用高效液相色譜法檢測其用藥部位根部中新棒狀酰胺的質量分數，考察該指標成分在不同生長期內的動態累積變化，探討兩面針藥材中該指標成分的變化規律，為合理采收及使用兩面針藥材提供可靠依據。

1 材料

1.1 藥材

采自位于南寧市良慶區錦亮村兩面針GAP種植研究基地，由研究基地的技術人員進行鑒定并采集。

1.2 儀器和試劑

Agilent 1200高效液相色譜系統(配有色譜工作站和DAD檢測器)，美國Agilent公司；AND HM-200電子天平，日本AND公司；RE52-98旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；As3120 超聲清洗儀，Automatic科學儀器公司；中藥切片機(青州三陽包裝設備有限公司)；250 mL索氏提取器；植物粉碎機(型號FZ102，天津市泰斯特儀器有限公司)。乙腈，色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇，色譜純，Fisher公司；超純水，電阻率18 MΩ·cm。新棒狀花椒酰胺對照品，由柳州兩面針股份有限公司功效研究組人員制備。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Eclipse XDB-C18高效液相色譜柱(4.6×250mm，5μm)，C18保護柱，檢測波長為275 nm，柱溫為40 ℃，流動相為乙腈∶水=60∶40，流速為1.0mL/min，進樣量為20μL，采用外標法定量。對照品的液相色譜圖見圖1。兩面針藥材中新棒狀花椒酰胺的液相色譜圖見圖2。

圖1 對照品的液相色譜圖(1-新棒狀花椒酰胺)

圖2 供試品的液相色譜圖(1-新棒狀花椒酰胺)

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取0.001g新棒狀花椒酰胺對照品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，搖勻，作為對照品溶液，避光保存備用。

2.3 供試品溶液的制備

選取生長期為2、3、5、7、10、13年生的兩面針藥材，選取已有5年生長期的兩面針藥材，每隔兩個月取同株根部的根須，分別用切片機切成片狀，再用粉碎機碎成3mm左右的細粉。精密稱取各試驗樣品細粉5.00g，置于索式提取器中，加90mL甲醇，加熱至微沸，冷凝回流提取至提取液無色后停止，提取液移出，用甲醇定容至100mL，避光保存備用。

2.4 標準曲線和線性回歸方程

準確量取對照品溶液0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、8.00mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得對照品溶液。取各濃度對照品溶液20μL，按上述色譜條件進樣測定，每個濃度進樣3次，以平均峰面積(Y)為縱坐標，對應的濃度(X)為橫坐標作標準曲線和線性回歸方程，得回歸方程：

Y=9160399.52X+0.3038515

r=0.9999

結果表明，在0.50～8.00μg/mL范圍內新棒狀花椒酰胺的質量濃度與峰面積的線性關系良好。

2.5 精密度試驗

取同一供試品溶液，連續進樣6次，測定新棒狀花椒酰胺的質量分數，其RSD為0．95%，表明精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12h測定新棒狀花椒酰胺的質量分數，計算結果RSD為1.23%。該結果表明供試品溶液在12h內保持穩定。

2.7 重復性試驗

取同一藥材共5份，每份約1.0g，精密稱定，分別制備供試品溶液并測定新棒狀花椒酰胺的質量分數，結果RSD為1.53%，表明重復性良好。

2.8 加樣回收試驗

稱取已知新棒狀花椒酰胺質量分數的藥材約1.0g，共6份，按2.3方法制備供試品溶液，分別精密加入適量對照品溶液并測定各供試品新棒狀花椒酰胺的質量分數。結果平均回收率為99．07%，RSD為1．61%。

2.9 樣品測定

分別取上述不同生長期的兩面針藥材約1.0g，精密稱定，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件測定各供試品溶液中新棒狀花椒酰胺的質量分數，每個樣品測定3次，取平均值，各測定結果見表1、表2。

表1 不同生長年份兩面針藥材新棒狀花椒酰胺的測定結果(n=3)

表2 5年生不同月份兩面針藥材新棒狀花椒酰胺的測定結果(n=3)

3 討論

藥材的生長受當地的海拔、水土、氣候等環境因素影響很大，不同產地的藥材質量存在較大偏差。本實驗所用的兩面針藥材均采自位于南寧良慶區錦亮村的兩面針GAP種植研究基地，該基地的藥材生長環境相同，并種植有不同年份的藥材，可供研究需要選擇適宜的藥材，樣品具有代表性。檢測結果表明，3年生長年期的兩面針藥材新棒狀花椒酰胺質量分數已達到較高值，5生長年期的兩面針藥材新棒狀花椒酰胺質量分數達到峰值，之后呈現一個平穩的狀態，生長期超過10年的兩面針藥材新棒狀花椒酰胺質量分數呈下降趨勢；對于同一年的藥材，在每年的前半年，兩面針新棒狀花椒酰胺質量分數呈小幅下降趨勢，而下半年則呈上升趨勢，12月達到高峰。

兩面針藥材中新棒狀花椒酰胺和氯化兩面針堿都是主要生物活性物質，兩者都是衡量和控制兩面針藥材質量的重要指標。本研究結果顯示，不同生長期和不同季節的兩面針藥材，其新棒狀花椒酰胺質量分數存在一個動態累積變化的過程，3年生長期的兩面針即可采收，有5年生長期的最佳；而對于同期的藥材，10～12月份新棒狀花椒酰胺質量分數達到最高，而這個季節也正是氣候比較干燥的時期，有利于藥材的晾曬和保存。