腎功能衰竭并發醫院獲得性感染患者致病菌的分布和耐藥特點及患者血清白細胞介素10基因多態性與細菌耐藥的相關性▲

黃詩斯 李 芬 廖曉梅 彭玉鳳

(湖南省郴州市第一人民醫院檢驗醫學中心，郴州市 423000，電子郵箱：hssjhmb@163.com)

腎功能衰竭是各種腎臟疾病的終末期表現形式，主要表現為生化水平及內分泌代謝嚴重紊亂。據調查，近20年來，我國腎功能衰竭的發病率為0.01%[1-2]。腎功能衰竭的內科治療方式主要為透析治療，以改善患者清除能力及防止并發癥發生，治療目的是代替腎臟的排泄功能 ，清除體內的各種毒素。腎功能衰竭患者常見的并發癥包括心血管并發癥及醫院獲得性感染等，其中并發感染患者的病死率達15%～38%，為患者死亡的第二大原因[3-4]。據報道，腎功能衰竭患者醫院獲得性感染的病原菌主要以革蘭陰性菌為主[5]，多表現為肺部感染及泌尿系統感染，但是不同研究中主要的病原菌分布及耐藥性分析的結果不一[6-7]。醫院獲得性感染的危險因素包括高齡、低蛋白血癥、透析時間等，但目前關于醫院獲得性感染與患者基因多態性相關性的研究報道較少。有研究顯示，白細胞介素10(interleukin 10,IL-10)作為常用的炎癥指標，其基因多態性與終末期腎病患者的肺部感染的發生有關[8]，而IL-10的基因多態性是否與細菌多重耐藥相關尚不可知。本研究探討腎功能衰竭并發醫院獲得性感染患者的病原菌分布特點，并分析其血清IL-10的rs1800871、rs1800872及rs1800896基因位點與細菌多重耐藥的相關性，為腎功能衰竭并發醫院獲得性感染患者的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至2020年6月就診于我院腎內科的165例腎功能衰竭患者作為研究對象。納入標準：(1)患者確診為腎功能衰竭且年齡≤75歲；(2)無其他嚴重合并癥；(3)在入院之前未發生感染；(4)自愿同意參加本研究并簽署知情同意書。排除標準：(1)終末期腎功能衰竭、急性腎功能衰竭患者；(2)合并其他腎臟疾病患者。165例患者中男性109例、女性56例，年齡(48.6±8.37)歲。本研究獲得我院醫學倫理委員會批準。

1.2 標本采集 按照《全國臨床檢驗操作規程》[9]中的標準規范采集并發醫院獲得性感染患者的標本，其中疑似呼吸道感染患者采集晨起痰液標本，疑似泌尿系統感染患者采集中段尿標本，皮膚感染患者采集皮膚分泌物標本，其余感染或疑似感染患者采集前臂靜脈血。采集完畢之后送至檢驗科微生物實驗室進行細菌培養及耐藥性分析。治療期間，根據需要可多次采集標本進行檢驗。

1.3 細菌培養及耐藥性分析 血液標本采用全自動血培養儀進行菌株鑒定，其余標本接種至培養皿中培養，對培養出的病原菌選擇純菌落后使用全自動細菌檢定儀(法國生物梅里埃公司，型號：VITEK?2Compact)進行菌株測定，質控菌株(來自國家衛生健康委員會臨床檢驗中心)為銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922，每周作標準菌株質控校核1次，保證結果的準確性。藥敏實驗采用全自動微生物藥敏分析儀(德國西門子公司，型號：MicroScan WalkAway 96 Plus)及配套的藥敏卡進行檢測，頭孢哌酮/舒巴坦使用紙片擴散法進行驗證，根據美國臨床實驗室標準委員會推薦的藥敏試驗操作方法和判斷標準對藥物的敏感性進行劃分[10]。細菌耐藥率=(耐藥+中介)株數/總株數×100%。多重耐藥主要是對臨床使用的三類或三類以上抗菌藥物同時出現耐藥的細菌。

1.4 基因多態性分析

1.4.1 血樣標本的采集及保存：采集并發醫院獲得性感染患者的外周靜脈血5 mL于枸櫞酸鈉抗凝管中，顛倒混勻后填寫編號，于-80℃下冷凍保存。

1.4.2 標本DNA提取：按照QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒(荷蘭Qiagen公司，批號：51104)說明書的使用方法，首先將血液標本低溫融化后，取0.1 mL標本至離心管中，加入蛋白酶K 20 μL，混勻后加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)，加入試劑盒中的Buffer AL 0.2 mL，混勻后56℃消化10 min裂解樣本，充分裂解后加入0.2 nL乙醇，8 000 r/min離心1 min洗脫。將濾液放置于新的制備管中，加入0.5 mL的Buffer AW1震蕩30 s，8 000 r/min離心1 min；將濾液放置于新的制備管中，再加入0.5 mL的Buffer AW2震蕩30 s，14 000 r/min離心1 min；將濾液放置于新的制備管中，最后加入80 μL Buffer AE，靜置5 min后8 000 r/min離心1 min，留取收集管中的DNA洗脫液。吸取5 μL DNA提取物，再用蒸餾水稀釋至1 mL，移至分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司，型號：Nano-300)的比色槽中，讀取吸光度260/吸光度280處的比值，比值在1.8～2.0之間表示DNA純度較好。

1.4.3 基因分型檢測：使用高通量單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)分型技術對IL-10基因進行分型檢測，在 NCBI 數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中查找IL-10基因的全長序列，根據文獻[11-12]篩選IL-10與感染相關的多態性位點，分別為rs1800871、rs1800872及rs1800896。采用 Primer 3軟件特異性連接引物，由上海生工生物股份有限公司合成。3個SNP位點的引物序列如下：rs1800871上游引物序列為5′-TCATTCTATGGTGGAGATGG-3′，下游引物序列為5′-TGGGGGAAGTGGCTAAGAGT-3′；rs1800872上游引物序列為5′-CCTCAGCACTACCTGACTAGC-3′，下游引物序列為5′-GGTGAGCACTACCTGACTAGC-3′； rs1800896上游引物序列為：5′-CCAAGACAACACTACTAAGGCTCCTTT-3′，下游引物序列為5′-GCTTCTTATATGCTAGTCAGGTA-3′。

1.4.4 PCR擴增：使用PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司，型號：Bio-Rad S1000)進行擴增，PCR總反應體系為50 μL，其中PCR Master Mix 25 μL、模板DNA 2.5 μL、上下游引物各0.25 μL，剩余的用無酶水補齊。rs1800896擴增條件為:94℃，5 min，預變性；94℃，20 s變性；56℃，30 s退火；72℃，30 s延伸；共35個循環；最后72℃末端延伸3 min。rs1800871擴增條件為：94℃，5 min預變性；94℃，20 s變性；62℃，30 s退火；72℃，50 s延伸；共35個循環；72℃末端延伸3 min。rs1800872擴增條件為：94℃，5 min預變性；94℃，20 s變性；60℃，30 s退火；72℃，50 s延伸；共35個循環；72℃末端延伸3 min。

1.4.5 PCR 產物的酶切：使用限制性內切酶對PCR產物進行酶切：將0.2 μL的PCR擴增產物、1 μL緩沖液、0.1 μL限制性內切酶及6.9 μL無酶水加入EP管中，充分混勻后放入37℃的恒溫恒濕箱中，反應30 min。rs1800871、rs1800872及rs1800896的限制性內切酶分別為MaeⅢ、RsaⅠ、BseRⅠ。

1.4.6 SNP位點的基因型分型：配制6%聚丙烯酰胺凝膠，加入電泳緩沖液，在加樣孔中加入5 μL DNA Marker、1 μL 6×DNA上樣緩沖液和5 μL DNA酶切產物，在其余加樣孔中依次加入上述緩沖液和DNA酶切產物，調節電壓300 V，電泳30 min后取出凝膠。將凝膠放于1‰硝酸銀溶液中，待充分染色后收集硝酸銀溶液，清洗凝膠后加入氫氧化鈉顯色溶液至DNA條帶顯色。觀察顯色的條帶數目并依次記錄DNA分型結果。

1.5 醫院獲得性感染的診斷標準 住院患者在住院期間發生的感染或醫院內獲得出院后發生的感染，不包括入院前已開始或已存在的感染。

1.6 統計學分析 采用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析。計數資料以例數和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或校正χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 腎功能衰竭并發醫院獲得性感染患者的一般情況 本研究中，腎功能衰竭患者并發醫院獲得性感染的比例為54.55%(90/165)，其中男性63例、女性27例，年齡38～75(54.3±8.65)歲，感染部位多發生在呼吸道及泌尿系統，其他感染部位有消化道、腹膜及導管處皮膚等，具體情況見表1。

表1 腎功能衰竭并發醫院獲得性感染患者的一般情況

2.2 腎功能衰竭并發醫院獲得性感染患者的病原菌分布 90例腎衰竭并發醫院獲得性感染患者共計送檢樣本134份，送檢樣本包括痰樣本、血樣本及分泌物等，同一患者僅保留相同細菌第一株(剔除重復菌株)，共培養出108株病原菌，檢出陽性率為80.60%。病原菌分布以革蘭陰性菌為主，共計64株，占比為59.26%，其中以銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯、大腸埃希菌為主。革蘭陽性菌共計32株，占比為29.63%，以金黃色葡萄球菌為主。少數患者先后培養出不同病原菌，如銅綠假單胞與白色假絲酵母菌、鮑曼不動桿菌與銅綠假單胞菌等。見表2。

表2 腎功能衰竭并發醫院獲得性感染患者的病原菌分布情況(n)

2.3 革蘭陰性菌對常用抗生素的耐藥性分析 細菌耐藥性分析結果顯示：銅綠假單胞菌中多重耐藥菌為4株，占比為10.53%(4/38)；銅綠假單胞菌對頭孢曲松、亞胺培南及頭孢他啶的耐藥率較高，對阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦及慶大霉素的敏感性較高。肺炎克雷伯多重耐藥菌為2株，占比20.00%(2/10)；肺炎克雷伯對頭孢他啶、頭孢曲松及左氧氟沙星的耐藥率較高。大腸埃希菌多重耐藥菌為1株，占比12.50%(1/8)；大腸埃希菌對頭孢曲松、左氧氟沙星及頭孢他啶的耐藥率較高。見表3。

表3 革蘭陰性菌對常用抗生素的耐藥情況

2.4 革蘭陽性菌對常用抗生素的耐藥性分析 細菌耐藥性分析結果顯示：金黃色葡萄球菌中多重耐藥菌為6株，占比25.00%(6/24)，其中金黃色葡萄球菌對苯唑西林的耐藥率較高，對萬古霉素的敏感度較高。肺炎鏈球菌未檢出多重耐藥菌株，其對阿米卡星的耐藥率最高。溶血葡萄球菌未檢出多重耐藥菌株，其對阿米卡星、苯唑西林、慶大霉素的耐藥率較高。見表4。

表4 革蘭陽性菌對常用抗生素的耐藥情況

2.5 腎功能衰竭并發醫院獲得性感染患者血清IL-10基因多態性與細菌耐藥的相關性分析 根據細菌多重耐藥的分析結果，將菌株分為多重耐藥組(n=13)及非多重耐藥組(n=95)，分析血清IL-10基因多態性與細菌多重耐藥的相關性。結果顯示：rs1800896位點的AA基因型在非耐藥組中的比例明顯升高，而GG基因型在非耐藥組中的比例明顯降低(均P<0.05)；rs1800871位點及rs1800872位點各基因型與細菌多重耐藥無明顯相關性(均P>0.05)。見表5。

表5 腎功能衰竭并發院內獲得性感染患者血清IL-10基因多態性與細菌耐藥的相關性[n(%)]

3 討 論

腎功能衰竭患者由于內環境紊亂，毒素無法及時排出體外，加之蛋白攝入量有限，營養狀況欠佳，容易發生感染等并發癥[13]。由于腎功能衰竭患者的腎功能減退，極大地限制了其對臨床常用抗生素的使用，探討患者感染的發生原因并分析病原菌的耐藥特點，對經驗性治療腎功能衰竭并發感染患者具有重大意義。Laranjinha等[14]研究結果表明，終末期慢性腎功能衰竭患者由于營養不良、機體免疫力下降、腎功能嚴重損害等導致患者透析耐受性下降，如此惡性循環使患者容易發生肺部感染。吳麗英等[15]研究表明，呼吸道感染是慢性腎功能衰竭血液透析患者合并感染的首要類型，與本研究結果相似。泌尿系統感染是醫院獲得性感染的常見類型，腎功能衰竭患者由于腎臟過濾功能減退，在少尿或無尿狀態下，尿液沖洗作用減退，使定植于泌尿道中的細菌發生逆行感染，從而導致泌尿系統感染發生[16]。本研究發現，泌尿系統感染的癥狀較呼吸道感染癥狀隱匿，患者腎衰竭的原發癥狀與泌尿系統感染癥狀時常混淆，容易被忽略。尿常規檢查簡單易行且可判斷感染發生情況，因此臨床醫師應提高腎功能衰竭患者尿常規的檢測頻率，盡早發現泌尿系統感染的跡象，盡快治療。

本研究細菌培養及藥敏結果顯示，患者感染的病原菌以革蘭陰性菌為主，其中銅綠假單胞菌占59.38%(38/64)，多重耐藥菌占10.53%(4/38)。在臨床上，醫務人員在監測到多重耐藥菌后，應當及時下隔離醫囑，并落實消毒隔離等措施，加強院感防控。本研究細菌耐藥性分析結果顯示，銅綠假單胞菌對頭孢曲松、亞胺培南及頭孢他啶的耐藥率較高，對阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦及慶大霉素的敏感性較高。但是由于患者腎功能減退，選擇抗菌藥物時應參考患者的內生肌酐清除率[17]，若確實需要使用影響腎功能的抗生素時，一定要密切監測患者腎功能。雖然銅綠假單胞菌感染患者對阿米卡星、慶大霉素等氨基糖苷類抗生素的敏感性較高，但由于這兩類藥物具有腎毒性，應盡量避免使用[18]；頭孢哌酮/舒巴坦在輕中度腎功能損害時可按原劑量使用，重度腎臟損害時需減量使用，敏感度較高的左氧氟沙星則均需減量使用[19]。本研究結果顯示，肺炎克雷伯菌感染時宜選擇頭孢哌酮/舒巴坦抗感染，大腸埃希菌感染時則可選用亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦及哌拉西林/他唑巴坦抗感染。

本研究中，革蘭陽性菌感染病原菌以金黃色葡萄球菌為主，金黃色葡萄球菌對萬古霉素的敏感度較高，因此萬古霉素可作為甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌感染的首選，但是在腎功能衰竭患者中應用萬古霉素應當十分小心，如確需使用，應先計算患者的肌酐清除率，根據患者的肌酐清除率確定給藥間隔及給藥劑量，當肌酐清除率為40～110 mL/min時，建議每12 h給藥1次；20～40 mL/min時，每24 h給藥1次；小于20 mL/min時，每48 h給藥1次；若患者正在進行血液透析，則注意監測患者的血液濃度，使患者的血藥谷濃度維持在15 mg/L以上[20]。

IL-10作為炎癥反應的關鍵調控因子，其基因多態性與多種感染性疾病相關[21-23]。研究表明，IL-10參與并調控腎功能衰竭患者的肺部感染，IL-10基因rs1554286位點中的G等位基因和rs1518111位點中的C等位基因可促進肺部感染的發生[24-26]。本研究細菌多重耐藥性分析結果顯示，IL-10基因rs1800896位點的AA基因型在非耐藥組中的比例明顯升高，而GG基因型在非耐藥組中的比例明顯降低(均P<0.05)，這提示rs1800896位點的AA基因型為抗生素治療的有利因素，而GG基因型為抗生素治療的不利因素。有關潰瘍性結腸炎及兒童腸道病毒性感染的研究結果均顯示IL-10基因的rs1800871和rs1800872位點的基因多態性與細菌感染或病毒感染的嚴重程度無關[11,27]，本研究結果也顯示，rs1800871和rs1800872位點的基因多態性與細菌耐藥無明顯相關性，提示在IL-10參與的感染中，rs1800871和rs1800872位點可能與感染過程和治療效果無關。

綜上所述，腎功能衰竭患者并發醫院獲得性感染的概率較高，病原菌以銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌為主，且多重耐藥率較高，選擇治療方案時應以患者的藥敏結果及腎功能指標為參考，合理選擇抗菌藥物，且患者血清IL-10的rs1800896基因多態性與細菌多重耐藥相關。但由于本研究樣本量有限，今后尚需擴大樣本量對患者IL-10基因多態性與不同細菌多重耐藥的相關性進行分析，進一步明確IL-10的基因多態性與細菌耐藥的關系。