CD2相關(guān)蛋白與其他足細胞相關(guān)蛋白間互相作用的研究進展▲

王 瓊 劉運廣 董凱華 顏嘉葳

(1 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西百色市 533000,電子郵箱：1834252464@qq.com；2 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，廣西百色市 533000；3 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院兒科,北京市 100015)

【提要】 足細胞足突融合消失和蛋白尿是腎小球疾病的共同特征，了解足細胞的生物學(xué)特性，對研究足細胞損傷機制、靶向治療具有重要意義。裂孔隔膜作為足細胞重要組成部分之一，對維持腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)及功能、限制蛋白濾過起關(guān)鍵作用。CD2相關(guān)蛋白(CD2AP)作為裂孔隔膜的代表性蛋白之一，與細胞骨架相關(guān)蛋白、其他裂孔隔膜蛋白、基底膜區(qū)蛋白、頂膜區(qū)蛋白和離子通道蛋白存在相互作用，共同影響足細胞形態(tài)學(xué)和動力學(xué)。本文圍繞CD2AP與足細胞相關(guān)蛋白的相互作用進行綜述，為探討蛋白尿的發(fā)生機制提供參考。

蛋白尿是腎臟疾病的主要標(biāo)志，同時也是導(dǎo)致腎功能惡化進展的獨立因素，其嚴重程度可反映腎臟病變的嚴重程度[1]。蛋白尿的發(fā)生與腎臟的濾過屏障結(jié)構(gòu)完整性破壞密切相關(guān)。有學(xué)者借助分子生物學(xué)研究手段，發(fā)現(xiàn)足細胞相關(guān)蛋白在維持腎臟濾過功能上發(fā)揮重要作用，并且不同蛋白之間關(guān)系密切[2-3]。CD2相關(guān)蛋白(CD2-associated protein，CD2AP)作為重要足細胞分子之一，在維持腎臟濾過屏障的結(jié)構(gòu)及功能完整性上起著重要作用。本文主要就CD2AP與其他足細胞相關(guān)蛋白之間相互關(guān)系做一綜述。

1 足細胞的結(jié)構(gòu)與功能

腎小球濾過屏障可阻止包括白蛋白在內(nèi)的血漿大分子進入尿液，該結(jié)構(gòu)由電荷屏障和機械屏障構(gòu)成，其中機械屏障由有孔的內(nèi)皮細胞、腎小球基底膜和足細胞組成。足細胞是一種終末分化細胞，其作為構(gòu)成腎小球濾過屏障的最后一道屏障，附著于腎小球毛細血管襻的外側(cè)。足細胞可分為結(jié)構(gòu)和功能不同的3個部分：細胞體、初級突起(亦稱主突)、足突。相鄰足細胞的足突呈相互交叉嵌合，并形成寬約40 nm的濾過裂孔，裂孔由極薄的裂孔隔膜相連，成為阻止蛋白質(zhì)等大分子濾過的最后屏障。足細胞正常功能的發(fā)揮及其在腎小球基底膜上的穩(wěn)定附著，均依賴于足細胞相關(guān)蛋白的維持。而根據(jù)足細胞的分布情況和功能，足細胞相關(guān)蛋白可分為細胞骨架蛋白、裂孔隔膜蛋白、基底膜區(qū)蛋白、頂膜區(qū)蛋白、離子通道蛋白，這些蛋白共同構(gòu)成腎小球濾過屏障，能夠有效選擇血漿中的濾過成分，從而維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

2 CD2AP

CD2AP是人足細胞裂孔隔膜特異性表達的蛋白。在空間結(jié)構(gòu)上，CD2AP由中央的卷曲線圈域和外周的4個對稱基序構(gòu)成，而外周的每個基序中均含有3個SH3球狀結(jié)構(gòu)域；從氨基酸序列上看，CD2AP的NH2末端包含3個SH3結(jié)構(gòu)域，中間區(qū)域為富含脯氨酸區(qū)域，COOH末端包含一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和肌動蛋白結(jié)合位點[4]。其中，CD2AP的SH3結(jié)構(gòu)域與脯氨酸線性識別序列結(jié)合。Rouka等[5]研究了每個SH3結(jié)構(gòu)域與已知交互因子Casitas B譜系淋巴瘤蛋白(Casitas B-lineage lymphoma，CBL)的結(jié)合特性，并進行了基于識別PxPxPR基序的肽微陣列篩選，發(fā)現(xiàn)多種可結(jié)合蛋白，如CBL、凋亡相關(guān)基因2相互作用蛋白X(apoptosis-linked gene 2-interacting protein X，ALIX)、Ras和Rab結(jié)合因子3分子等；3個SH3結(jié)構(gòu)域?qū)@些結(jié)合蛋白的識別和結(jié)合存在顯著差異：CD2AP的SH3-1和SH3-2結(jié)構(gòu)域通常與具有相似特征的肽配體結(jié)合，而SH3-3結(jié)構(gòu)域與大多數(shù)的肽配體結(jié)合較弱，但可識別ALIX中異常延伸的序列。有研究表明SH3-3的一個突變(p.K301M)可能在遺傳性局灶節(jié)段性腎小球硬化中起作用[6]。有學(xué)者進一步研究發(fā)現(xiàn)，CD2AP的SH3-1結(jié)構(gòu)域Y10位的酪氨酸對于維持其自身功能不可或缺[7]。

3 CD2AP與其他足細胞相關(guān)蛋白之間的相互作用

3.1 CD2AP與細胞骨架蛋白之間的相互作用 足細胞胞體和主突的細胞骨架是由微管和富含桿狀蛋白的中間絲構(gòu)成。足突的細胞骨架由富含F(xiàn)-肌動蛋白的微絲構(gòu)成，微絲形成環(huán)狀束呈縱向排列；環(huán)狀束之間由密集的輔肌動蛋白連接，在足突與主突的移行處，環(huán)狀束彎曲與主突的微絲及微管相連，這樣的結(jié)構(gòu)特性使足細胞具有對抗腎小囊內(nèi)張力的能力[8]。

3.1.1 CD2AP與肌動蛋白：足細胞的分化伴隨著細胞骨架的重排和細胞形態(tài)的變化。而CD2AP在足細胞分化中起重要作用[9]。Lehtonen等[10]發(fā)現(xiàn)，CD2AP和F-肌動蛋白在體外培養(yǎng)小鼠腎皮質(zhì)集合管細胞中存在部分共定位現(xiàn)象，肌動蛋白細胞骨架的破壞可導(dǎo)致內(nèi)源性CD2AP解體，考慮這種相互作用是通過CD2AP的COOH末端介導(dǎo)的。He等[11]發(fā)現(xiàn)，白蛋白過載可引起永生化小鼠足細胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的p17亞基表達上調(diào)、F-肌動蛋白細胞骨架破壞及CD2AP表達降低，從而引起足細胞啟動凋亡程序；而用CD2AP真核表達載體轉(zhuǎn)染這些細胞后可逆轉(zhuǎn)上述改變，考慮CD2AP可能參與抑制促凋亡的轉(zhuǎn)化生長因子β信號傳導(dǎo)以維持足細胞穩(wěn)態(tài)。Zhao等[12]也發(fā)現(xiàn)，在增強肌動蛋白加帽蛋白和肌動蛋白結(jié)合蛋白促進Arp2/3復(fù)合物介導(dǎo)的肌動蛋白組裝的能力方面，CD2AP起著關(guān)鍵的支架作用。由此可見，CD2AP可從多個方面影響肌動蛋白細胞骨架，CD2AP異常表達及分布均導(dǎo)致其穩(wěn)定性的破壞，而這可引起蛋白尿的發(fā)生。

3.1.2 CD2AP與F-肌動蛋白結(jié)合蛋白：目前已發(fā)現(xiàn)F-肌動蛋白結(jié)合蛋白有α-輔肌動蛋白-4、突觸足蛋白、結(jié)蛋白、波形蛋白和巢蛋白等。(1)α-輔肌動蛋白-4連接F-肌動蛋白，具有調(diào)節(jié)足細胞機械動力的作用[13]。在α-輔肌動蛋白-4缺陷小鼠中可觀察到其足細胞與裂孔隔膜結(jié)合差，易引起足細胞之間分離，從而導(dǎo)致足細胞損傷[14]。由此可見，作為裂孔隔膜特異性表達的蛋白，CD2AP與α-輔肌動蛋白-4有著密切的空間關(guān)聯(lián)。(2)突觸足蛋白可介導(dǎo)包含α-輔肌動蛋白-4和β-連環(huán)蛋白的復(fù)合物的形成，并與肌球蛋白Ⅱ相互作用，從而參與調(diào)節(jié)足細胞的運動功能[15]。Huber等[16]發(fā)現(xiàn)CD2AP和突觸足蛋白可以直接相互作用，推斷這種相互作用是由CD2AP的SH3結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸的突觸足蛋白片段結(jié)合而實現(xiàn)的，其中至少有2種不同的富含脯氨酸的片段可以與CD2AP結(jié)合。突觸足蛋白是α-輔肌動蛋白-4的張力敏感調(diào)節(jié)劑，而敲除犬腎細胞MDCK細胞中的突觸足蛋白可導(dǎo)致α-輔肌動蛋白-4和F-肌動蛋白在細胞連接處的積聚急劇減少，引起Venus-α-輔肌動蛋白在成熟單層濾過屏障中從細胞連接處重新定位到細胞質(zhì)中[15]。由此推測CD2AP和突觸足蛋白同時也存在間接作用。(3)結(jié)蛋白是一種細胞骨架中間絲蛋白，與其他蛋白共同構(gòu)建細胞骨架結(jié)構(gòu)。正常情況下，結(jié)蛋白在足細胞中不表達，當(dāng)足細胞受到損傷時，結(jié)蛋白表達升高以應(yīng)對損害。Wang等[17]在表現(xiàn)為大量蛋白尿的阿霉素腎病大鼠中發(fā)現(xiàn)，腎小球足細胞裂隙膜蛋白(podocin)、腎病蛋白(nephrin)等裂隙隔膜蛋白的表達下調(diào)，而CD2AP和中間絲蛋白-結(jié)蛋白的表達上調(diào)。但目前CD2AP與結(jié)蛋白之間的具體作用尚未確定。(4)目前尚未有研究證實波形蛋白、巢蛋白與CD2AP有直接作用關(guān)系。綜上，CD2AP可通過調(diào)節(jié)相關(guān)F-肌動蛋白結(jié)合蛋白來影響細胞骨架，從而對維持細胞骨架結(jié)構(gòu)、保證正常濾過功能具有重要作用。

3.2 CD2AP與裂孔隔膜蛋白之間的相互作用 腎小球裂孔隔膜作為選擇性屏障，可防止大分子過濾到超濾液中，并受到來自腎小球濾液流動所引起的剪切應(yīng)力的影響。裂孔隔膜蛋白包含了在黏附和緊密連接處表達的蛋白，如P-鈣黏蛋白、E-鈣黏蛋白、閉塞小帶-1、軸突蛋白、受體酪氨酸激酶亞家族Eph的配體B1、緊密連接蛋白、α-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白、γ-連環(huán)蛋白、閉合蛋白、鈣/鈣調(diào)素依賴性絲氨酸蛋白激酶、連接黏附分子、膜相關(guān)鳥苷酸激酶轉(zhuǎn)化蛋白2和鈣黏蛋白等，以及足細胞特有的蛋白，如受體酪氨酸激酶亞家族Eph的配體(nephrin)、podocin、NEPH和CD2AP等[18-19]。

podocin可將nephrin和CD2AP募集到裂孔隔膜上，然后通過其COOH末端與CD2AP和nephrin結(jié)合，從而形成nephrin-podocin-CD2AP復(fù)合物，嵌入脂筏中[20-21]。podocin、nephrin、CD2AP之間存在相互作用：nephrin也是一種信號分子，而podocin可顯著增強nephrin誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，從而激活絲裂原活化蛋白激酶[22]；nephrin和CD2AP在體內(nèi)與磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)的p85調(diào)節(jié)亞基相互作用，將PI3K募集到質(zhì)膜，并與podocin一起刺激足細胞中依賴PI3K的蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號傳導(dǎo)，而PI3K/Akt信號的激活是維持足細胞功能完整性的重要組成部分[23]。有研究表明，Akt活性較低的大鼠腎小球上皮細胞合成的應(yīng)力纖維較多，上調(diào)Akt活性后，這些細胞的應(yīng)力纖維合成減少，而應(yīng)力纖維影響著肌動蛋白骨架的分布[24]。由此推測，nephrin-CD2AP-PI3K/Akt復(fù)合物參與調(diào)節(jié)足細胞的肌動蛋白細胞骨架。

鈣黏蛋白是一組鈣依賴性黏附分子，參與著細胞與細胞之間的黏附。足細胞的裂隙隔膜是一種特殊的黏附結(jié)構(gòu)，含有幾種支架蛋白，包括P-鈣黏蛋白、CD2AP和FAT蛋白[25]。 Tang等[26]通過蛋白質(zhì)印跡檢測發(fā)現(xiàn)，在敲除CD2AP基因的MDCK細胞系中，E-鈣黏蛋白水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化；但用單個解卷積光學(xué)圖像比較E-鈣黏蛋白、CD2AP和F-肌動蛋白的連接強度，發(fā)現(xiàn)E-鈣黏蛋白與CD2AP水平存在中等相關(guān)性，E-鈣黏蛋白在敲除CD2AP基因的MDCK細胞上分布減少。但目前尚未明確CD2AP與P-鈣黏蛋白、FAT鈣黏蛋白相互作用。

ephrin-B1在裂隙隔膜處表達，參與維持裂隙隔膜分子的正確排列和裂隙隔膜的屏障功能[27]。Hashimoto等[28]發(fā)現(xiàn)ephrin-B1、nephrin和CD2AP在大鼠足細胞上存在共定位現(xiàn)象；用小干擾RNA靶向抑制這些細胞中的ephrin-B1表達，發(fā)現(xiàn)CD2AP僅在細胞核周圍表達。該結(jié)果表明ephrin-B1有助于 CD2AP 在足細胞中的正確定位。但目前尚未有研究發(fā)現(xiàn)ephrin-B1與CD2AP存在直接的相互作用。

NEPH1、閉塞小帶-1等蛋白協(xié)助維持著裂孔隔膜的屏障功能，目前尚無研究發(fā)現(xiàn)CD2AP與這些分子的直接作用。

3.3 CD2AP與基底膜區(qū)蛋白之間的相互作用 基底膜區(qū)蛋白在維持細胞正常形態(tài)、足突與基膜的相互作用以及足突的正常定位具有重要作用。整合蛋白α3β1是主要的足細胞基底膜區(qū)蛋白，其在足細胞中高度表達。整合蛋白α3β1等黏附復(fù)合物與基底膜上的層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白等蛋白相互連接，進而將基底膜與足細胞的肌動蛋白細胞骨架相聯(lián)系，從而使足細胞牢固地錨定在基底膜上[29-30]。Karabulut等[2]對發(fā)生腎結(jié)石病變大鼠的足細胞進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)這些細胞的CD2AP表達上調(diào)，而整合蛋白α3β1 表達下調(diào)。雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)CD2AP與足細胞高度表達的整合蛋白α3β1之間存在直接相互作用，但這些基底區(qū)蛋白通過間接相互作用來影響著CD2AP的表達與分布。

3.4 CD2AP與頂膜區(qū)蛋白 由于足細胞標(biāo)記蛋白(podocalyxin)、平足蛋白(podoplanin)、podoendin和腎小球上皮蛋白等頂膜區(qū)蛋白的存在，頂膜結(jié)構(gòu)域帶負電荷，可有效阻止白蛋白通過[18-19]。這些蛋白對于足細胞的功能具有重要意義。Refaeli等[31]通過敲除處于毛細血管袢末期小鼠足細胞的podocalyxin基因，并對這些細胞進行podocalyxin和podocin免疫熒光共染色，發(fā)現(xiàn)podocalyxin和podocin表達均減少，并且podocin已錯誤定位到足細胞細胞體的頂膜區(qū)，推測podocalyxin有助于裂隙隔膜相關(guān)蛋白podocin在細胞上正確定位。而由上文可知podocin通過其COOH末端與CD2AP與nephrin結(jié)合，因此推測podocalyxin可間接影響CD2AP。但目前暫無研究表明CD2AP與podocalyxin、podoplanin、podoendin和腎小球上皮蛋白這些分子之間存在直接相互作用。

3.5 CD2AP與離子通道相關(guān)蛋白 離子通道對維持正常足細胞功能至關(guān)重要，該通道的失調(diào)可能導(dǎo)致足細胞內(nèi)外離子失衡，進而造成足細胞損傷。腎小球足細胞表達 瞬時受體電位陽離子通道亞家族C(transient receptor potential cation channel subfamily C,TRPC)1、TRPC3、TRPC4、TRPC5和TRPC6蛋白；使用電生理學(xué)和藥理學(xué)方法進行分析發(fā)現(xiàn)，目前只有TRPC3、TRPC5和TRPC6被證明有助于鈣進入足細胞[32]。Reiser等[33]通過共定位研究發(fā)現(xiàn)，TRPC6與裂隙隔膜蛋白nephrin、podocin和CD2AP 相關(guān)；免疫印跡檢測結(jié)果顯示TRPC6僅與nephrin和podocin有直接相互作用，而不是 CD2AP。另外，目前也尚未發(fā)現(xiàn)TRPC3、TRPC5與CD2AP有存在著直接或間接相互作用。

4 小 結(jié)

足細胞結(jié)構(gòu)的完整性是維持腎小球正常濾過功能的基礎(chǔ)。這些結(jié)構(gòu)的異常均會導(dǎo)致足細胞的結(jié)構(gòu)異常，最終引起蛋白尿的產(chǎn)生。CD2AP與細胞骨架蛋白、裂隙隔膜蛋白、基底膜區(qū)蛋白、離子通道蛋白存在相互作用，這種相互作用是足細胞維持結(jié)構(gòu)與功能完整性的基礎(chǔ)；而在病理條件下，CD2AP的表達和分布異常可以影響著細胞骨架、肌動蛋白結(jié)構(gòu)的完整性，同時改變了裂隙隔膜的分子組成，間接影響著頂端膜的完整性。因此，從CD2AP角度進一步探討足細胞分子間相互作用機制，為足細胞損傷的靶點治療提供了全新的思路，將產(chǎn)生革命性變革，具有重大意義。