丙泊酚對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟脂質堆積、肝損傷及氧化應激的調節作用▲

石 磊 馬玉林 方 圓 周銀芳

(陜西省安康市中心醫院1 麻醉科，2 檢驗科，安康市 725000，電子郵箱：shilei251204191@126.com)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種慢性肝病，其疾病譜包括單純性脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化和肝細胞癌[1]。高熱量飲食導致的脂質堆積是誘發NAFLD的首要病因，在我國，脂肪肝的發病率以每年0.594% 的速度增長[2-3]。NAFLD的進展受到多種機制調控，如脂質堆積、氧化應激、炎性級聯反應等[4-6]。NAFLD的主要治療方案包括飲食控制、體重控制、運動和藥物控制，但效果不明顯[7]。許多藥物(如他汀類、貝特類)常伴有不良反應的發生[8]。因此，亟待尋找療效確切、無副作用的治療NAFLD的藥物。丙泊酚是臨床上廣泛使用的靜脈全麻藥物，具有可迅速喚醒的優點，可連續輸注且在體內無積累[9]。研究表明，丙泊酚對腎臟和肝臟等器官具有積極的保護作用，可保護肝缺血/再灌注損傷[10-12]。但是目前關于丙泊酚在NAFLD治療中的作用的研究仍較少。本研究采用高脂高糖飲食建立大鼠NAFLD模型，探討丙泊酚對NAFLD大鼠模型肝損傷及氧化應激的調節作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 丙泊酚(批號：PHR1663)購自美國Sigma公司；HE染液(批號：G1120)、油紅O(批號：G1260)染液購自北京索萊寶公司；脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)試劑盒(批號：QIA39)購自美國Sigma公司；RIPA裂解液(批號：P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0012)購自碧云天生物公司；B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因(批號：ab196495)抗體、抗Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)(批號：ab32503)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-coA carboxylase，ACC)(批號：ab45174)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆IgG二抗、β-肌動蛋白(β-actin，批號：ab6728)均購自英國Abcam公司；抗肉毒堿棕櫚酰基轉移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT-1)(批號：orb308786)抗體購自英國Biorbyt公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(批號：A001-1-2)、丙二醛(批號：A003-1-2) 和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)(批號：A020-1-2)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。3100型全自動生化分析儀購自日本日立公司；Multiskan MK3型酶標儀購自中國賽默飛世爾公司；Mini Protean 3 Cell型電泳儀、CFX Connect96型熒光定量PCR儀均購自美國Bio-Rad公司；Tanon 5200型全自動化學發光分析儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 實驗動物 40只SPF級健康SD雄性大鼠，3周齡，體重(60±10)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號為SYXK(京)2019-0022。將大鼠置于恒定溫度(23±2)℃的室內，保持12 h/12 h的明暗循環，并自由飲水和進食。

1.3 NAFLD大鼠模型的建立及實驗分組 參考文獻[13]，適應性喂養7 d后，將40只大鼠按隨機數字表法分為對照組、模型組、丙泊酚低劑量組、丙泊酚中劑量組、丙泊酚高劑量組，每組8只。對照組大鼠喂食標準大鼠食物，即每千克食物包含48%玉米、20%大豆粉、10%麥麩、10%面粉、8%魚粉、2%粉煤灰、1%植物油、0.5%鹽和0.5%微量元素，按照1.5 mg/(kg·d)喂食，直至實驗結束。模型組與丙泊酚處理組大鼠喂食高脂高糖食物，每千克食物中包含72%標準大鼠食物、20%豬油、2%膽固醇、5%蛋黃粉、1%膽汁鹽，按照1.5 mg/(kg·d)喂食；喂養6周后，丙泊酚低劑量組、丙泊酚中劑量組、丙泊酚高劑量組大鼠分別加入25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg丙泊酚繼續喂食4周，每天1次，模型組繼續喂食高脂高糖食物，直至實驗結束。大鼠毛色暗淡無光澤、精神萎靡、飲食量較多和體重增加且血脂異常，表明NAFLD大鼠模型建立成功，建模成功率為81.25%。

1.4 樣品采集 丙泊酚處理4周后，將所有大鼠禁食過夜后麻醉，采取大鼠眼眶神經叢血液，約1 mL/只，經3 500 r/min低溫離心5 min后，吸取上層血清，儲存于-80℃環境中待檢。對動物實施安樂死并切除肝臟，稱量大鼠肝臟重量，計算肝指數，肝指數=(肝臟重量/大鼠體重)×100%，然后將一部分肝臟置于-80℃下進行蛋白免疫印跡試驗，另一部分置于4%多聚甲醛中進行組織學分析。

1.5 全自動生化分析儀測量大鼠血清脂質代謝指標水平 采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中LDL、三酰甘油、總膽固醇和HDL水平。

1.6 HE染色觀察肝臟組織病理學變化 采用4%多聚甲醛溶液固定肝臟組織24 h以上，將肝臟組織置于脫水機內，用濃度由低到高的乙醇依次進行梯度脫水后，于包埋機內進行包埋，隨后于石蠟切片機上進行切片，片厚4 μm。然后將切片依次用二甲苯和乙醇進行脫蠟處理，蘇木素染色10 min，1%的鹽酸乙醇分化，洗凈后0.6%氨水返藍，流水沖洗，伊紅染色2 min后，將切片依次用乙醇和二甲苯處理至脫水透明，用中性樹膠封片，通過光學顯微鏡觀察肝臟組織病理學變化。

1.7 TUNEL染色檢測肝細胞凋亡情況 石蠟組織切片制備同1.6，取石蠟切片用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)清洗3次，每次5 min，然后與含有末端脫氧核苷酸轉移酶和生物素化脫氧尿苷三磷酸的TUNEL反應混合物于37℃下孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min，在37℃的洗滌緩沖液中孵育30 min終止反應。在光學顯微鏡下隨機選取5個視野計數TUNEL陽性細胞(棕色)的數量。細胞凋亡率=(TUNEL陽性細胞數/總細胞數)×100%。

1.8 蛋白免疫印跡試驗 用RIPA裂解緩沖液在4℃下提取各組大鼠肝組織蛋白質，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠對等量蛋白質(30 μg)進行電泳，然后轉移到聚偏氟乙烯膜上。用含5%脫脂牛奶的TBST封閉膜1 h后，用稀釋的一抗Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶2 000)、CPT-1(1 ∶500)和ACC(1 ∶500)4℃孵育過夜。然后，將膜與辣根過氧化物酶結合的二抗(1 ∶3 000)于37℃下孵育1 h，并使用增強化學發光試劑ECL顯示條帶，用ImageJ定量蛋白灰度值。蛋白相對表達量以目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示。

1.9 氧化應激指標水平檢測 按照試劑盒說明書，分別采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)、硫代巴比妥酸法和比色法檢測1.4保存的大鼠血清中的SOD、丙二醛和LDH的含量。

1.10 油紅O染色觀察肝細胞脂質分解情況 石蠟組織切片制備同1.6，取石蠟切片用PBS清洗3次，每次5 min，用油紅O工作液浸泡切片10 min，PBS清洗3次，每次5 min，再用油紅O染液染色15 min，75%乙醇分化2 s， 37℃蒸餾水洗15 s，然后用蘇木素染色，1%的鹽酸乙醇分化，洗凈后0.6%氨水返藍，流水沖洗，用中性樹脂封片后，在光學顯微鏡下觀測大鼠肝細胞脂質分解情況。脂肪被染成鮮紅色，細胞核染成深藍色。

1.11 統計學分析 采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠肝重量和肝指數的比較 模型組大鼠的肝臟重量和肝指數均高于對照組(均P<0.05)；丙泊酚中、高劑量組大鼠的肝臟重量低于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的肝臟重量均低于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，而丙泊酚低劑量組大鼠的肝臟重量和肝指數與模型組比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肝臟重量和肝指數的比較(x±s)

2.2 各組大鼠血清脂質代謝指標水平的比較 模型組大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇水平均高于對照組，血清HDL水平低于對照組(均P<0.05)；丙泊酚中、高劑量組大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇水平均低于模型組，血清HDL水平高于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇水平均低于丙泊酚中劑量組，血清HDL水平高于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，而丙泊酚低劑量大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇、HDL水平與模型組比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清脂質代謝指標水平的比較(x±s)

2.3 各組大鼠肝臟組織病理變化及細胞凋亡率的比較 對照組大鼠的肝臟組織形態正常，模型組大鼠的肝小葉結構紊亂、極度腫脹、脂肪空泡大，細胞脂肪變性或壞死增加；與模型組相比，丙泊酚處理組大鼠的肝臟組織病變程度呈劑量依賴性減輕，肝小葉排列逐漸整齊，脂肪空泡變小，細胞脂肪變性減少，見圖1。模型組大鼠的肝臟組織細胞凋亡率及Bax與Bcl-2相對表達量的比值(Bax/Bcl-2)均高于對照組(均P<0.05)；丙泊酚中、高劑量組大鼠的肝臟組織細胞凋亡率及Bax/Bcl-2均低于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的肝臟組織細胞凋亡率及Bax/Bcl-2均低于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)；而丙泊酚低劑量大鼠的肝臟組織細胞凋亡率與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，但肝臟組織Bax/Bcl-2低于模型組(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 各組大鼠肝臟組織細胞凋亡率及Bax與Bcl-2相對表達量比值的比較(x±s)

圖1 各組大鼠肝臟組織病理學變化及肝細胞凋亡情況[HE染色(×400)、TUNEL染色(×400)]

圖2 各組大鼠Bcl-2和Bax蛋白表達情況

2.4 各組大鼠血清氧化應激指標水平的比較 模型組大鼠的血清丙二醛、LDH水平均高于對照組，血清SOD水平低于對照組(均P<0.05)；丙泊酚中、高劑量組大鼠的血清丙二醛、LDH水平均低于模型組，血清SOD水平高于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的血清丙二醛、LDH水平均低于丙泊酚中劑量組，血清SOD水平高于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，而丙泊酚低劑量組大鼠血清丙二醛、LDH、SOD水平與模型組比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清氧化應激指標水平的比較(x±s)

2.5 各組大鼠肝細胞脂質分解情況及ACC、CPT-1相對表達量的比較 對照組大鼠肝臟組織中的小脂質滴散布在少量肝細胞中，模型組大鼠肝細胞充滿了大小不同的紅色脂滴，融合成片，看不清細胞結構；與模型組相比，隨著丙泊酚劑量的增加，大鼠肝細胞中脂質滴明顯變小、減少，見圖3。模型組大鼠的肝臟組織CPT-1相對表達量低于對照組，ACC相對表達量高于對照組(均P<0.05)；丙泊酚中、高劑量組大鼠的肝臟組織CPT-1相對表達量均高于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的肝臟組織CPT-1相對表達量高于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)；丙泊酚低、中、高劑量組大鼠的肝臟組織ACC相對表達量均低于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠肝臟組織的ACC相對表達水平低于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，見表5，圖4。

表5 各組大鼠肝臟組織ACC、CPT-1相對表達量的比較(x±s)

圖3 大鼠肝臟脂肪細胞油紅O染色(×400)

圖4 各組大鼠ACCHE CPT-1蛋白表達的情況

3 討 論

高熱量食物的攝入會導致脂質堆積、炎性細胞因子過度產生和巨噬細胞浸潤，從而促進肝病的進展[14]。因此，高脂、富含膽固醇的飲食通常用于高脂血癥和NAFLD的實驗誘導。研究表明，給大鼠喂食高脂飼料可引起大鼠出現胰島素抵抗、脂質代謝異常和肝臟損傷等NAFLD疾病特征[15]。本研究通過高脂高糖飲食誘導建立NAFLD大鼠模型，結果顯示，模型組大鼠的肝臟重量和肝指數均較對照組明顯升高(均P<0.05)，表明模型組大鼠已存在脂肪肝；丙泊酚中、高劑量組大鼠的肝臟重量和肝指數均低于模型組，且丙泊酚高劑量組肝臟重量低于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，而丙泊酚低劑量組大鼠的肝臟重量和肝指數與模型組比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，提示給予高劑量(100 mg/kg)的丙泊酚干預能夠有效地減輕NAFLD大鼠的肥胖體征。

“兩次打擊”理論是目前大多數學者認可的影響NAFLD進展的作用機制，即第一次打擊是肝細胞中脂質的堆積，第二次打擊是氧化應激誘導的脂毒性，其促進了NASH的細胞損傷[16-17]。HDL主要由肝臟合成，因其體積小而能夠自由進出動脈管壁并攝取沉浸在血管壁內膜底層的LDL、三酰甘油、總膽固醇等有害物質，然后將這些有害物質轉運到肝臟進行代謝清除[18]。總膽固醇、三酰甘油和LDL水平升高以及HDL水平降低是高脂血癥的主要癥狀，而血脂異常是NAFLD的主要危險因素，血清三酰甘油、總膽固醇、LDL和HDL水平能夠反映NAFLD的病變程度[19]。本研究結果顯示，模型組大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇水平均高于對照組，血清HDL水平低于對照組(均P<0.05)，這表明模型組大鼠血脂異常、脂質代謝紊亂；丙泊酚中、高劑量組大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇水平均低于模型組，血清HDL水平高于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇水平均低于丙泊酚中劑量組，血清HDL水平高于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，而丙泊酚低劑量組大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇、HDL水平與模型組比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，這提示給予高劑量(100 mg/kg)的丙泊酚干預能降低NAFLD大鼠血清三酰甘油、總膽固醇和LDL水平，提高HDL水平，具有明顯的降脂作用。

作為NAFLD診斷的“黃金標準”，HE染色為評估藥物的抗肝脂肪變性作用提供了可靠證據。本研究HE染色結果顯示，NAFLD大鼠的肝小葉結構紊亂、極度腫脹、脂肪空泡大，細胞脂肪變性或壞死增加，而丙泊酚能夠有效地改善肝組織病變。研究證實，丙泊酚可通過調節Toll樣受體4/核因子κB/核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3途徑減輕炎癥反應和細胞凋亡，從而保護D-半乳糖胺/脂多糖誘導的急性肝損傷[10]。本研究結果顯示，模型組大鼠的肝臟組織細胞凋亡率及Bax/Bcl-2均高于對照組(均P<0.05)；丙泊酚中、高劑量組大鼠的肝臟組織細胞凋亡率，以及丙泊酚低、中、高劑量組大鼠的肝臟組織Bax/Bcl-2均低于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的肝臟組織細胞凋亡率及Bax/Bcl-2均低于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，這提示：給予高劑量(100 mg/kg)的丙泊酚干預對NAFLD大鼠的肝損傷具有明顯的保護作用。

氧化應激是NASH發病和病情進展的主要決定因素[20]。丙二醛是脂質過氧化降解的主要產物，它會引起膜蛋白和酶反應，增強膜通透性，改變細胞膜的結構、功能和新陳代謝，最終對人體造成傷害[21]。SOD是一種包含金屬元素的酶，廣泛分布于各種生物中，可以消除自由基并防止體內脂質氧化損傷[22]。LDH是一種糖酵解酶，可以催化丙酮酸生成乳酸，是肝損傷的標志物[23]。丙泊酚含有抗氧化活性的酚羥基，可通過抑制活性氧釋放，降低H9c2細胞衰老相關基因的蛋白表達，從而具有心臟保護作用[24]。本研究結果顯示，模型組大鼠的血清丙二醛、LDH水平均高于對照組，血清SOD水平低于對照組(均P<0.05)；丙泊酚中、高劑量組大鼠的血清丙二醛、LDH水平均低于模型組，血清SOD水平高于對照組，且丙泊酚高劑量組大鼠的血清丙二醛、LDH水平均低于丙泊酚中劑量組，血清SOD水平高于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，而丙泊酚低劑量組大鼠血清丙二醛、LDH、SOD水平與模型組比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，這提示丙泊酚能提高大鼠的抗氧化能力，給予高劑量(100 mg/kg)的丙泊酚可以通過抑制氧化應激反應來減輕NAFLD大鼠的肝損傷。

油紅O是一種脂溶性偶氮染料，能特異性地使組織和細胞內中性三酰甘油、脂質以及脂蛋白等染成紅色。本研究結果顯示，模型組大鼠肝細胞油紅O染色脂滴呈彌漫性分布，且肝細胞中分解代謝標志物CPT-1相對表達量低于對照組，合成代謝標記物ACC高于對照組，丙泊酚中、高劑量組大鼠的肝臟組織CPT-1相對表達量均高于模型組，丙泊酚低、中、高劑量組大鼠的肝臟組織ACC相對表達量均低于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的肝臟組織CPT-1相對表達量高于丙泊酚中劑量組、ACC相對表達量低于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)。這提示，丙泊酚可減少NAFLD大鼠肝細胞中的脂質滴，并上調CPT-1及下調ACC的表達，給予高劑量(100 mg/kg)的丙泊酚干預可促進NAFLD大鼠肝細胞中脂質的分解以阻止NAFLD進展。

綜上所述，給予高劑量(100 mg/kg)的丙泊酚干預不僅能夠降低NAFLD大鼠的肝臟重量及肝指數，調節NAFLD引起的脂質代謝紊亂、促進脂質分解，還可以緩解氧化應激及細胞凋亡造成的肝損傷，阻止NAFLD的進一步發展。