多囊卵巢綜合征伴不孕患者單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平與胚胎發育及新鮮胚胎周期臨床結局的相關性分析▲

賈新轉 劉二緩 王聰敏 張 娜 魏 蘭

(1 河北醫科大學第四醫院生殖醫學科，河北省石家莊市 050011，電子郵箱：9376868@qq.com；2 河北省深州市醫院手術室，深州市 053800；3 河北省胸科醫院胸外科，石家莊市 050041)

移植胚胎的質量是影響輔助生殖技術治療效果的主要因素之一。盡管大多數成熟卵母細胞可以受精，但只有一小部分可發育到囊胚階段[1]。如何確定卵母細胞及胚胎的發育潛力仍是目前研究的熱點。由于卵泡液存在于卵泡腔內，并包繞于卵母細胞周圍，更多學者傾向于在卵泡液中尋找評估卵母細胞質量的標志物[2]。近年來關于混合卵泡液中維生素D水平的研究結果顯示，卵泡液中高維生素D水平不利于體外受精結局[3]；卵泡液中低維生素D水平與較高的流產率相關[4]；進行體外受精的女性補充維生素D后可改善子宮內膜質量，提高臨床妊娠率[5]；多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)伴有不孕的患者補充維生素D可改善胚胎質量，提高臨床妊娠率[6]。但關于單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平的研究較少。本研究探討PCOS伴不孕患者單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平與胚胎發育及新鮮胚胎周期臨床結局的相關性，為臨床評估卵母細胞受精、胚胎發育情況及臨床結局提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020年1～9月在河北醫科大學第四醫院生殖醫學科初次就診且需進行體外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)治療的97例PCOS患者作為研究對象。納入標準：(1)根據2004年鹿特丹標準[7]診斷為PCOS；(2)PCOS伴有原發性不孕(即有正常性生活的女性，同居1年從未妊娠)，且需行IVF-ET(新鮮胚胎周期)治療；(3)年齡25～30歲，體質指數18.5～23.9 kg/m2。排除標準：(1)配偶精液異常；(2)患有子宮內膜異位癥或其他子宮器質性疾病；(3)自身或配偶有吸煙、飲酒等不良嗜好；(4)患有高血壓、糖尿病、自身免疫性疾病、甲狀腺功能異常、惡性腫瘤；(5)患有重要臟器(如心、腦、肺、肝、腎等)疾病；(6)入組前3個月內服用過維生素制劑；(7)新鮮胚胎周期中行多胚胎移植。本研究通過河北醫科大學第四醫院醫學倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 卵巢刺激方案 于月經周期第2天或第3天給予卵巢刺激方案治療。皮下注射促性腺激素[重組人促卵泡刺激素注射液(商品名：果納芬，廠家：默克雪蘭諾有限公司，規格：450 IU/支，進口藥品注冊證號：S20160040)]，150～225 IU/次(根據患者體質指數調整劑量。體質指數為18～20 kg/m2給予150 IU/次，20～24 kg/m2給予225 IU/次)，1次/d ，連續給藥至艾澤注射日。給予重組人促卵泡刺激素注射液治療3～4 d后進行經陰道彩超檢查卵泡直徑，采集清晨空腹靜脈血3 mL檢測雌二醇水平，根據檢測出的卵泡直徑決定下次檢查的時間(卵泡直徑≥12 mm，下次檢查時間為1～2 d后；卵泡直徑<12 mm，下次檢查時間為3～4 d后)。當第1個卵泡直徑達到12 mm或雌二醇水平達到200 pg/mL時，皮下注射醋酸加尼瑞克注射液(商品名：晴樂，廠家：正大天晴藥業集團股份有限公司，規格：0.25 mg/支，國藥準字H20183025)抑制垂體，0.25 mg/次，1次/d，連續用藥至艾澤注射日。用藥后1～2 d進行經陰道彩超觀察卵泡直徑，根據檢查結果決定下次檢查時間(卵泡直徑<14 mm，下次檢查時間為本次檢查后2 d，卵泡直徑≥14 mm，下次檢查時間為本次檢查后1 d)。當至少有1個卵泡直徑達到18 mm或2個卵泡最大直徑達到16 mm時，給予皮下注射重組人絨毛膜促性腺激素(商品名：艾澤，廠家：默克雪蘭諾有限公司，規格：250 μg/支，進口藥品注冊證號：S20130091)250 μg。

1.3 卵泡液的收集 皮下注射重組人絨毛膜促性腺激素(艾澤)36 h后，進行經陰道超聲引導下取卵：常規消毒、鋪無菌單，經陰道超聲引導下，將21 G單腔取卵針連接到封閉真空系統，選擇最大直徑≥16 mm的卵泡進行取卵，收集單個卵泡內容物至單獨的試管內，避免沖洗液和血液污染卵泡內容物，將卵泡內容物經37℃恒溫傳送窗口傳入胚胎實驗室中，立即檢查卵泡內容物中是否存在卵母細胞，當存在卵母細胞時，將卵母細胞置于培養皿中，將剩余卵泡液于37℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液置于-80℃冰箱避光保存待測。

1.4 卵泡液中脂溶性維生素水平的測定 于37℃恒溫下測定1.3中成熟卵母細胞的卵泡液中脂溶性維生素水平。委托北京和合醫學檢驗所檢測維生素A、維生素E水平，檢測方法為高效液相色譜法，檢測儀器為日本島津公司生產的高效液相色譜儀(型號LC-20A)；采用酶聯免疫吸附法檢測維生素D、維生素K水平，檢測儀器為瑞士澳斯邦公司生產的JC028酶標儀，試劑盒購自英國IDS公司(批號：AC-57SF1)、上海科順生物科技有限公司(批號：KS18407)。

1.5 胚胎質量及形態學等級的評估 依據Istanbul共識[8]評估胚胎質量。培養第3天(D3)的優質胚胎指有8個對稱的、無碎片的卵裂球；培養第5天(D5)的優質胚胎指已經完全擴展(4級)到孵化(5級)的胚胎，且具有高質量的內細胞團(1級)和滋養外胚層(1級)。胚胎形態等級評分[3]：D3根據卵裂球數量(4～8個卵裂球分別計4～8分)、碎片等級(1級為碎片不超過5%，2級為碎片占6%～10%，3級為碎片占11%～15%，4級為碎片占16%～50%，分別計4～1分)和卵裂球是否勻稱(1級為卵裂球勻稱或大致勻稱，2級為卵裂球不勻稱，分別計2分、1分)對胚胎形態學等級進行評分；D5根據囊胚擴展分級(1～6級，分別計1～6分)、內細胞團質量(1～3級，分別計3～1分)和滋養外胚層細胞質量(1～3級，分別計3～1分)對胚胎形態學等級進行評分。D3、D5胚胎形態學等級評分為各項評分之和。

1.6 臨床妊娠判定 于新鮮胚胎周期單胚胎移植后35 d行B超檢查可見子宮內孕囊判定為臨床妊娠。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/胚胎移植總周期數×100%。

1.7 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料以(x±s)表示；非正態分布的計量資料以[M(P25，P75)]表示。采用Spearman相關分析卵泡液中脂溶性維生素水平與D3、D5胚胎形態學等級評分的相關性；采用多因素Logistic模型回歸分析卵泡液中脂溶性維生素水平與卵母細胞受精狀況、D3和D5胚胎發育情況，以及新鮮胚胎周期臨床結局的相關性。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 研究對象的一般資料、卵泡液中脂溶性維生素水平、胚胎發育及臨床結局情況 共收集到97名患者的成熟卵母細胞1 036個。1 036個成熟卵母細胞的單個卵泡卵泡液中維生素A水平為656.27(628.50，688.00)ng/mL，維生素D水平為21.39(17.22，22.91)ng/mL，維生素E水平為3 129.55(3 052.26，3 193.00)ng/mL，維生素K水平為0.72(0.71，0.73)ng/mL。831個成熟卵母細胞成功受精，發育至D3的胚胎718個(其中優質胚胎236個，非優質胚胎482個)，發育至D5的胚胎397個(其中優質胚胎158個，非優質胚胎239個)。新鮮胚胎周期(單胚胎移植)中D3移植胚胎82個，D5移植胚胎15個，臨床妊娠42例，臨床妊娠率為43.30%(42/97)。見表1。

表1 研究對象的一般資料、卵泡液中脂溶性維生素水平、胚胎發育及臨床結局情況

2.2 單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平與其對應的卵母細胞受精狀況的相關性的多因素Logistic回歸分析 以卵母細胞受精狀況為因變量(未受精=0，受精=1)，以單個卵泡卵泡液中維生素A、維生素D、維生素E、維生素K水平為自變量(均以實測值納入)，進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，單個卵泡卵泡液中維生素A、維生素E水平與其對應的卵母細胞成功受精均相關(均P<0.05)，而維生素D、維生素K水平與其對應的卵母細胞受精與否均無相關性(均P>0.05)。見表2。

表2 單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平與其對應的卵母細胞受精情況的相關性的多因素Logistic回歸分析

2.3 單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平與D3胚胎發育情況的相關性的多因素Logistic回歸分析 以D3胚胎發育情況為因變量(未能發育至D3=0，發育至D3=1)，以單個卵泡卵泡液中維生素A、維生素D、維生素E、維生素K水平為自變量(均以實測值納入)，進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，單個卵泡卵泡液中維生素D水平與其對應的胚胎能否發育至D3相關(P<0.05)，而維生素A、維生素E、維生素K水平與胚胎能否發育至D3均無相關性(均P>0.05)。見表3。

表3 單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平與D3胚胎發育情況的相關性的多因素Logistic回歸分析

2.4 單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平與D5胚胎發育情況的相關性的多因素Logistic回歸分析 以D5胚胎發育情況為因變量(未能發育至D5=0，發育至D5=1)，以單個卵泡卵泡液中維生素A、維生素D、維生素E、維生素K水平為自變量(均以實測值納入)，進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，單個卵泡卵泡液中維生素D水平與其對應的胚胎能否發育至D5相關(P<0.05)，而維生素A、維生素E、維生素K水平與胚胎能否發育至D5均無相關性(均P>0.05)。見表4。

表4 單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平與D5胚胎發育情況的相關性的多因素Logistic回歸分析

2.5 單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平與D3、D5胚胎形態學等級評分的相關性 單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素A(rs=0.012，P=0.864)、維生素D(rs=0.036，P=0.592)、維生素E(rs=0.074，P=0.275)、維生素K(rs=0.084，P=0.213)水平與D3胚胎形態學等級評分均無相關性(均P>0.05)。單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素A(rs=0.099，P=0.189)、維生素D(rs=0.030，P=0.692)、維生素E(rs=0.088，P=0.239)、維生素K(rs=0.046，P=0.544)水平與D5胚胎形態學等級評分均無相關性(均P>0.05)。

2.6 單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平與臨床結局的相關性的多因素Logistic回歸分析 以新鮮胚胎周期的臨床結局為因變量(未妊娠=0，妊娠=1)，以單個卵泡卵泡液中維生素A、維生素D、維生素E、維生素K水平為自變量(均以實測值納入)，進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，單個卵泡卵泡液中維生素D水平與臨床妊娠相關(P<0.05)，而維生素A、維生素E、維生素K水平與新鮮胚胎周期臨床妊娠均無相關性(均P>0.05)。見表5。

表5 單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平與臨床結局的相關性的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

脂溶性維生素包括維生素A、維生素D、維生素E、維生素K，在機體中發揮重要的生理功能，可作為激素前體或抗氧化劑參與人類生殖過程[9]。現有的研究大多集中于分析混合卵泡液中維生素水平對卵母細胞和胚胎質量的影響[3-4，9-14]，但并未有研究對單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平與卵母細胞的受精狀況、胚胎發育情況及質量、臨床結局的關系進行分析。檢測卵泡液中脂溶性維生素水平是分析卵母細胞微環境與其受精和發育潛能之間的相關性的最佳方法。故本研究旨在評估單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平對卵母細胞受精、胚胎發育及新鮮胚胎周期臨床結局的影響。

3.1 維生素A及維生素E 在健康的胚胎中，由于新組織的形成，活性氧產生增多，需要更高水平的抗氧化劑以維持平衡。已有研究證實卵泡液中存在活性氧和抗氧化物[15-17]，維生素A及維生素E均為機體抗氧化防御系統的非酶類強抗氧化劑，可改善氧化應激損傷、胰島素抵抗及糖脂代謝異常[9]。維生素A可減輕滋養細胞氧化應激，并可作為細胞外基質蛋白的輔助因子，調節胚胎形成、胎兒生長及妊娠進展過程[18]。過量的維生素E可拮抗其他脂溶性維生素的吸收和功能[19]。研究顯示，維生素A、維生素E有助于促進卵母細胞發育，提高胚胎質量[11-13]。本研究結果顯示，單個卵泡卵泡液中維生素A、維生素E水平均與其對應的卵母細胞成功受精相關(均P<0.05)，單個卵泡卵泡液中維生素A及維生素E水平升高是其對應的卵母細胞成功受精的保護因素，但其與D3、D5的胚胎發育情況、胚胎形態學等級評分及新鮮胚胎周期的臨床結局均無關(均P>0.05)，與既往研究[11-13]結果不完全一致，這可能是由于既往研究以混合卵泡液為標本進行檢測，而本研究是測定單個卵泡卵泡液中的維生素A及維生素E水平。

3.2 維生素D 在本研究中，單個卵泡卵泡液中維生素D水平與其對應的卵母細胞受精與否無相關性(P>0.05)，與Firouzabadi等[20]的研究結果一致。但另有研究報道，卵泡液中維生素D水平與受精率呈負相關[4]，而血清維生素D水平高的女性受精率高[21]。這可能是由于不同研究中卵泡液的收集方法或檢測標本不同所致。

維生素D作為轉錄因子，可調節CYP19基因的表達，而CYP19基因可編碼芳香化酶，后者是雌激素轉化過程中的主要酶[22]，維生素D缺乏可導致雌激素水平降低。另一方面，維生素D可調節PCOS女性的血清雄激素水平[23]，PCOS女性睪酮水平升高與受精率下降、胚胎發育率下降及流產率升高有關，高雄激素水平可能對卵泡生成和子宮內膜功能產生不利影響[24]。本研究結果顯示，單個卵泡卵泡液中維生素D水平與其對應的胚胎能否發育至D3、D5及新鮮胚胎周期的臨床妊娠情況均相關(均P<0.05)，而與D3、D5的胚胎形態學等級評分均無相關性(均P>0.05)，單個卵泡卵泡液中維生素D水平升高是胚胎發育至D3、D5及新鮮胚胎周期臨床妊娠的保護因素(均P<0.05)。在本課題組前期關于繼發性不孕女性(輸卵管因素、子宮內膜異位癥、PCOS、卵巢儲備不足所致)的研究中，混合卵泡液中維生素D高水平組IVF-ET的正常受精率、D3優質胚胎形成率、D5優質胚胎形成率、臨床妊娠率均高于維生素D低水平組[25]。本研究以單個卵泡卵泡液為標本測定脂溶性維生素水平，且在新鮮胚胎周期進行單胚胎移植，再次驗證了卵泡液中高維生素D水平在卵泡發育及臨床妊娠中具有保護作用。另有研究報告，卵泡液中維生素D水平可預測體外受精結局，充足的維生素D水平在子宮內膜容受性中發揮有益作用[26]；維生素D可通過子宮內膜的局部效應在體外受精和妊娠過程中發揮重要作用[27]。

3.3 維生素K 維生素K除參與凝血外，還具有改善骨質疏松、血管鈣化、胰島素敏感性的作用[27-29]。關于維生素K與生殖的關系的研究較少，有動物試驗表明添加維生素K2有利于牛體外胚胎發育[14]。在本研究中，單個卵泡卵泡液中維生素K水平是唯一與卵母細胞受精、胚胎發育及臨床妊娠均無關的脂溶性維生素。但目前國內外關于卵泡液中維生素K水平與臨床妊娠結局的相關研究較少，今后有待擴大樣本量進一步探討。

綜上所述，PCOS伴不孕女性單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素中，維生素A、維生素E水平升高是卵母細胞成功受精的保護因素，維生素D水平升高是胚胎發育及新鮮胚胎周期臨床妊娠的保護因素，而單個卵泡卵泡液中脂溶性維生素水平均與胚胎形態學等級評分無關。