Toll樣受體4及其調(diào)控的信號(hào)通路關(guān)鍵因子在HIV合并馬爾尼菲籃狀菌感染患者單核巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平及臨床意義▲

陳 潔 羅朝蓮,2 韋吳迪 陳榮鳳 梁 浩 蔣俊俊,3

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)再生醫(yī)學(xué)與醫(yī)用生物資源開(kāi)發(fā)應(yīng)用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心&廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧市 530021，電子郵箱：1527692073@qq.com；2 四川省婦幼保健院婦幼健康管理部，成都市 610045；3 廣西南寧市第四人民醫(yī)院，南寧市 530023)

AIDS由HIV感染所致，是全球重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。2020年全球有3 770萬(wàn)人感染HIV，約有68萬(wàn)人死于AIDS相關(guān)疾病[1]。馬爾尼菲籃狀菌(Talaromycesmarneffei，T.marneffei)感染是好發(fā)于AIDS患者的機(jī)會(huì)性真菌感染之一[2]。研究表明Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)4信號(hào)通路可以抵抗真菌感染[3]。TLR4識(shí)別抗原后通過(guò)激活宿主免疫細(xì)胞的兩大受體蛋白，即髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)和β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白，從而被招募到巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞膜表面，引起早期核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)的活化或晚期干擾素的產(chǎn)生[4]。但是TLR4信號(hào)通路是否在HIV合并T.marneffei感染患者中發(fā)揮抗T.marneffei的作用，目前尚未可知。本研究通過(guò)檢測(cè)HIV合并T.marneffei感染患者與單純HIV感染患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中巨噬細(xì)胞(單核巨噬細(xì)胞)的TLR4及其調(diào)控的信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)水平，探討TLR4信號(hào)通路與HIV合并T.marneffei感染的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 遵循知情同意的原則，選取在南寧市第四人民醫(yī)院確診為HIV感染但未經(jīng)抗病毒治療的35例住院患者作為研究對(duì)象，其中男性23例、女性12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)18周歲以上；(2)HIV抗體陽(yáng)性；(3)知情并同意參加本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)曾接受抗病毒治療；(2)近期曾接受抗真菌治療。T.marneffei感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)：具有T.marneffei感染相應(yīng)的癥狀和體征、影像學(xué)表現(xiàn)，以及血液和/或痰液、肺泡灌洗液、腦脊液等體液經(jīng)真菌培養(yǎng)證實(shí)為T(mén).marneffei感染或組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)T.marneffei。根據(jù)是否合并T.marneffei感染將患者分為合并T.marneffei感染組(15例)和單純HIV感染組(20例)。本研究獲得廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 資料收集 收集研究對(duì)象的電子病歷資料，包括年齡、性別、吸毒情況、合并癥情況、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和病毒載量等信息。其中CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、病毒載量由南寧市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科分別應(yīng)用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，型號(hào)：CytoFLEX2)和BD PharmingenTMAPC Mouse anti-Human CD4試劑盒(美國(guó)BD公司，生產(chǎn)批號(hào)：555349 )、全自動(dòng)病毒載量分析儀(美國(guó)Roche公司，型號(hào)：COBAS TaqMan 48)和COBAS TaqMan HIV-1 Test v2.0核酸定量檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Roche公司，生產(chǎn)批號(hào)：T01352)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 相關(guān)蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)

1.3.1 標(biāo)本的采集與PBMC的分離：采集研究對(duì)象外周靜脈血20 mL，運(yùn)用Ficoll梯度密度法分離PBMC[5]，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)后以磷酸緩沖鹽溶液(武漢博士德生物工程有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：PYG0021)將細(xì)胞稀釋至1×104個(gè)/μL備用。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核巨噬細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況：(1)取1×106個(gè)/100 μL 1.3.1中的PBMC懸液分裝6管，用于細(xì)胞內(nèi)蛋白流式抗體染色。先將CD68抗體(FITC Mouse anti-Human CD68；美國(guó)BD公司，生產(chǎn)批號(hào)：562117)加入檢測(cè)管用于標(biāo)記人PBMC中的巨噬細(xì)胞，然后分別加入TLR2抗體(FITC anti-Human CD282 TLR2 Antibody；美國(guó)BD公司，生產(chǎn)批號(hào)：392308)、TLR4抗體(PE Mouse anti-Human CD284 TLR4 Antibody；美國(guó)BD公司，生產(chǎn)批號(hào)：564215)、TLR9抗體(APC Rat anti-Human TLR9 Antibody；美國(guó)BD公司，生產(chǎn)批號(hào)：560428)、TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)抗體(PE Mouse anti-TBK1；美國(guó)BD公司，生產(chǎn)批號(hào)：558696)。設(shè)立空白組，只破膜，不做其他處理。(2)另取1.25×107個(gè)/100 μL 1.3.1中的PBMC懸液分裝5管，用于細(xì)胞外分泌蛋白流式抗體染色。于檢測(cè)管中分別加入γ干擾素抗體(PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-Human IFN-γ；美國(guó)BD公司，生產(chǎn)批號(hào)：560742)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)抗體(APC Rat anti-Human IL-6 Clone MQ2-13A5；美國(guó)BD公司，生產(chǎn)批號(hào)：561441)、MyD88抗體(MyD88 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody SC65-04；美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，生產(chǎn)批號(hào)：560431)、干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)抗體(Alexa Fluor 488 Mouse anti-IRF-7；美國(guó)BD公司，生產(chǎn)批號(hào)：558707)，空白管不加抗體，4℃避光孵育30 min。(3)CD68抗體的濃度是0.5 mg/mL，加入量為5 μL；TLR2抗體的濃度是1.0 mg/mL，加入量為5 μL；TLR4抗體的濃度是0.5 mg/mL，加入量為5 μL；TLR9抗體的濃度是2.0 mg/mL，加入量為20 μL；TBK1抗體的濃度是1.0 mg/mL，加入量為20 μL；γ干擾素抗體的濃度是0.25 mg/mL，加入量為5 μL；IL-6抗體的濃度是0.25 mg/mL，加入量為5 μL；MyD88抗體的濃度是1 mg/mL，加入量為2 μL；IRF7抗體的濃度是1.0 mg/mL，加入量為20 μL。加入相應(yīng)的抗體后應(yīng)用CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司，型號(hào)：CytoFLEX2)上機(jī)檢測(cè)。相關(guān)蛋白的表達(dá)量以平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescent intensity，MFI)表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel 2013與SPSS 23.0軟件包建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料以[M(P25，P75)]表示，組間比較采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者基本信息的比較 兩組患者的性別、吸毒情況、合并肺炎的比例、合并肺結(jié)核的比例、口腔念珠菌感染率、合并慢性肝炎(HBV或HCV)的比例、巨細(xì)胞病毒感染率、皰疹病毒感染率、合并腦膜炎的比例比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，而單純HIV感染組患者的年齡大于合并T.marneffei感染組(P<0.05)，提示兩組年齡不具備可比性，這可能是因?yàn)榧{入的樣本量太小。合并T.marneffei感染組的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)低于單純HIV感染組(P<0.05)；合并T.marneffei感染組的HIV病毒載量高于單純HIV感染組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組研究對(duì)象的基本信息的比較

2.2 兩組患者單核巨噬細(xì)胞中TLR2、TLR4、TLR9蛋白表達(dá)水平的比較 合并T.marneffei感染組患者單核巨噬細(xì)胞中TLR4蛋白的表達(dá)水平高于單純HIV感染組患者(P<0.05)；而兩組患者單核巨噬細(xì)胞中TLR2和TLR9蛋白的表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組單核巨噬細(xì)胞中TLR2、TLR4、TLR9蛋白表達(dá)水平的比較(MFI)

2.3 兩組患者單核巨噬細(xì)胞中MyD88、TBK1、IRF7、IL-6、γ干擾素蛋白表達(dá)水平的比較 合并T.marneffei感染組患者單核巨噬細(xì)胞中TLR4信號(hào)通路中間因子MyD88、TBK1、IRF7蛋白及下游炎癥因子IL-6、γ干擾素蛋白的表達(dá)水平均高于單純HIV感染組患者(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組單核巨噬細(xì)胞中MyD88、TBK1、IRF7、IL-6、γ干擾素蛋白表達(dá)水平的比較(MFI)

2.4 兩組不同CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)患者單核巨噬細(xì)胞中TLR4、TBK1、MyD88、IRF7、IL-6、γ干擾素蛋白表達(dá)水平的比較 合并T.marneffei感染組中有14例患者的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<200個(gè)/μL且均<100個(gè)/μL；單純HIV感染組中有16例患者的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<200個(gè)/μL，其中9例患者的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<100個(gè)/μL。在CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<200個(gè)/μL的患者中和CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<100個(gè)/μL的患者中，合并T.marneffei感染組的TLR4蛋白表達(dá)水平，TLR4信號(hào)通路中間因子TBK1、MyD88、IRF7的蛋白表達(dá)水平均高于單純HIV感染組，且在CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<200個(gè)/μL的患者中，合并T.marneffei感染組的γ干擾素蛋白表達(dá)水平高于單純HIV感染組，在CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<100個(gè)/μL的患者中，合并T.marneffei感染組的IL-6蛋白表達(dá)水平高于單純HIV感染組(均P<0.05)。見(jiàn)表4、表5。

表4 兩組CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<200個(gè)/μL患者單核巨噬細(xì)胞中TLR4、TBK1、MyD88、IRF7、IL-6、γ干擾素蛋白表達(dá)水平的比較(MFI)

表5 兩組CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<100個(gè)/μL患者單核巨噬細(xì)胞中TLR4、TBK1、MyD88、IRF7、IL-6、γ干擾素蛋白表達(dá)水平的比較(MFI)

3 討 論

已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CD4+T淋巴細(xì)胞水平低的AIDS患者更容易發(fā)生機(jī)會(huì)性感染， 其中CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<200個(gè)/μL的AIDS患者更容易發(fā)生T.marneffei感染，而抗病毒治療不能顯著降低AIDS患者感染T.marneffei的風(fēng)險(xiǎn)[6]。由此可見(jiàn)，AIDS患者發(fā)生T.marneffei感染等機(jī)會(huì)性感染的主要原因可能是CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，尤其當(dāng)CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<200個(gè)/μL時(shí)。本研究結(jié)果也顯示，合并T.marneffei感染組患者的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)低于單純HIV感染組(P<0.05)，并且合并T.marneffei感染組患者的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)大部分小于100個(gè)/μL，這與Chen等[7]的研究結(jié)果相似，提示HIV合并T.marneffei感染患者的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)更低。

研究顯示，TLR家族能增強(qiáng)宿主對(duì)致病性真菌的免疫應(yīng)答反應(yīng)[8]，TLR4和CD14可作為宿主對(duì)新生隱球菌、白色念珠菌等真菌產(chǎn)生免疫應(yīng)答的受體[9]。本研究結(jié)果顯示，HIV合并T.marneffei感染患者單核巨噬細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)水平明顯高于單純HIV感染的患者(P<0.05)，這可能與T.marneffei感染單核巨噬細(xì)胞后激活細(xì)胞表面的TLR4受體而產(chǎn)生免疫應(yīng)答有關(guān)。

MyD88是除TLR3之外的其余TLR信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)接分子，是TLR4信號(hào)通路中信號(hào)傳向下游必不可少的靶分子[10-11]。有研究顯示，免疫重建不良的HIV合并結(jié)核病患者的細(xì)胞因子失調(diào)是由TLR4/MyD88信號(hào)通路介導(dǎo)的[12]，可見(jiàn)在免疫重建不良的患者中TLR4/MyD88信號(hào)通路介導(dǎo)機(jī)體免疫的過(guò)度激活。本研究結(jié)果也顯示HIV合并T.marneffei感染患者的MyD88蛋白表達(dá)水平高于單純HIV感染患者(P<0.05)，原因可能是TLR4/MyD88信號(hào)通路在T.marneffei感染后過(guò)度激活，使下游炎癥因子IL-6釋放增加，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)T.marneffei感染的免疫應(yīng)答，而持續(xù)的慢性免疫激活是引起免疫失衡的重要原因。當(dāng)病毒核酸或其中間代謝產(chǎn)物與模式識(shí)別受體結(jié)合，可募集相應(yīng)的接頭蛋白、線粒體抗病毒信號(hào)蛋白、干擾素基因刺激因子和β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白來(lái)活化TBK1，從而促進(jìn)IRF3和IRF7磷酸化，進(jìn)一步誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素合成[13]。而我們也發(fā)現(xiàn)HIV合并T.marneffei感染患者單核巨噬細(xì)胞中TBK1蛋白表達(dá)水平高于單純HIV感染者(P<0.05)，提示HIV合并T.marneffei感染患者的TBK1處于過(guò)度激活狀態(tài)，可引起單核巨噬細(xì)胞的持續(xù)激活，使得機(jī)體免疫失衡，從而引起機(jī)會(huì)性感染的發(fā)生。IRF7是抗病毒天然免疫中調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的主要因子，也是TLR通路的中間因子，當(dāng)TLR識(shí)別HIV-1后，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6激活TBK1，同時(shí)IRF3、IRF7、NF-κB也被激活，啟動(dòng)天然免疫通路[14-15]。本研究結(jié)果顯示，HIV合并T.marneffei感染患者單核巨噬細(xì)胞中IRF7蛋白表達(dá)水平高于單純HIV感染者(P<0.05)，這提示IRF7可在過(guò)度激活狀態(tài)下促進(jìn)機(jī)會(huì)性T.marneffei感染的發(fā)生，并促進(jìn)AIDS的疾病進(jìn)展。

研究表明，IL-6水平與AIDS和AIDS相關(guān)免疫重建不良的發(fā)生率，以及AIDS相關(guān)的病死率呈正相關(guān)[16]。本研究結(jié)果也顯示在CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<100個(gè)/μL的患者中，HIV合并T.marneffei感染患者單核巨噬細(xì)胞中IL-6蛋白表達(dá)水平高于單純HIV感染者(P<0.05)，由此推測(cè)IL-6可能與HIV合并T.marneffei感染有關(guān)，IL-6 表達(dá)水平越高，HIV合并T.marneffei感染的概率可能越大。γ干擾素是單核巨噬細(xì)胞最重要的內(nèi)源性炎癥介質(zhì)之一，在促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的激活和宿主防御中發(fā)揮重要作用[17]。本研究結(jié)果也顯示在CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<200個(gè)/μL的患者中，γ干擾素在HIV合并T.marneffei感染患者單核巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平較單純HIV感染患者更高(P<0.05)，提示γ干擾素的表達(dá)水平可能與機(jī)體單核巨噬細(xì)胞抵抗T.marneffei感染的能力有關(guān)。

由于本研究中兩組患者之間的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)差異較大，并且不同CD4+T淋巴細(xì)胞水平可能會(huì)影響不同TLR4及其信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)，因此我們分別對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<200個(gè)/μL和CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<100個(gè)/μL這兩類患者的TLR2、TLR4、TLR9、TBK1、MyD88、IRF7、IL-6、γ干擾素的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析。本研究結(jié)果顯示，在CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)低于100個(gè)/μL的患者中，兩組γ干擾素的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示在免疫狀態(tài)更差的患者中，γ干擾素可能不會(huì)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)T.marneffei的防御能力。而在CD4+T淋巴細(xì)胞<200個(gè)/μL的患者中，合并T.marneffei感染組γ干擾素的蛋白表達(dá)水平高于單純HIV感染組(P<0.05)，提示γ干擾素可能有助于機(jī)體抵抗T.marneffei感染。同時(shí)，在CD4+T淋巴細(xì)胞<100個(gè)/μL的患者中，合并T.marneffei感染組IL-6的蛋白表達(dá)水平高于單純HIV感染組(P<0.05)，提示IL-6表達(dá)的增加可能有助于免疫狀態(tài)更差的機(jī)體抵抗T.marneffei感染。本研究發(fā)現(xiàn)，在CD4+T淋巴細(xì)胞<200個(gè)/μL的患者和CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<100個(gè)/μL的患者中，TLR2和TLR9的蛋白表達(dá)水平在合并T.marneffei感染組和單純HIV感染組中的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。本研究還發(fā)現(xiàn)，CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<200個(gè)/μL的患者和CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<100個(gè)/μL的患者中，合并T.marneffei感染組的TLR4、TBK1、MyD88、IRF7的蛋白表達(dá)水平均高于單純HIV感染組(均P<0.05)。原因可能是T.marneffei通過(guò)激活單核巨噬細(xì)胞表面的TLR4受體，影響TLR4/MyD88和TLR4/TBK1信號(hào)通路，引起中間因子MyD88、TBK1、IRF7表達(dá)上調(diào)，使免疫處于過(guò)度激活狀態(tài)，導(dǎo)致機(jī)體免疫失衡，從而引起機(jī)會(huì)性感染的發(fā)生。

綜上所述，TLR4及其信號(hào)通路相關(guān)因子在HIV合并T.marneffei感染患者單核巨噬細(xì)胞中異常表達(dá)，這可能是促進(jìn)HIV合并T.marneffei感染、影響HIV的病程進(jìn)展的因素之一。其通過(guò)以下兩個(gè)方面起作用：一方面是通過(guò)激活MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，促進(jìn)IL-6等炎癥因子的表達(dá)，從而參與單核巨噬細(xì)胞的炎癥免疫反應(yīng)；另一方面，TLR4通過(guò)激活TBK1等激酶，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子IRF7被激活并入核，并誘導(dǎo)γ干擾素的分泌，提示HIV患者在合并T.marneffei感染后開(kāi)啟了免疫應(yīng)答反應(yīng)，這為基于天然免疫模式識(shí)別受體開(kāi)發(fā)新的藥物靶點(diǎn)和治療方案提供了依據(jù)。但本研究納入的樣本量過(guò)少，研究結(jié)論尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究驗(yàn)證。