白細胞介素-8 基因多態性與顱內動脈粥樣硬化性狹窄的相關性分析

高 策，黃建敏，蔣勇明，云艷芳，楊長燕，陳海燕

（1.右江民族醫學院研究生學院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫學院附屬醫院神經內科，廣西 百色 533000）

顱內動脈粥樣硬化性狹窄（intracranial atherosclerotic stenosis，ICAS）是以進行性脂質沉積、纖維組織增生和炎性細胞浸潤為特征的病理過程，既能緩慢加重血管狹窄，又能引起栓子脫落堵塞血管，導致腦血液循環障礙，現已經成為缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）的重要病因[1]。隨著人們生活水平的提高，IS 發病率也在以每年8.7%的速率遞增[2]。IS 因具有高致殘率及致死率的特點，給患者及其家庭、社會帶來了極重的負擔。因此，探究ICAS 的致病機制對IS 防治具有重要意義。在動脈粥樣硬化形成眾多機制學說中，慢性炎癥與動脈粥樣硬化密切相關，其中白細胞介素-8（interleukin，IL-8）作為經典炎癥趨化因子，不僅能夠促進中性粒細胞在炎癥細胞的聚集，同時也能誘導血管內皮細胞及平滑肌細胞增殖和遷移，更易促進動脈粥樣硬化形成[3]。目前臨床關于IL-8 基因多態性與動脈粥樣硬化的研究相對較少，尤其是IL-8 基因啟動子-251A/T 位點。基于此，本研究主要探究IL-8 基因-251A/T 位點與ICAS 易感性的關系，現報道如下。

1 資料及方法

1.1 一般資料 選取2018 年10 月-2019 年10 月在右江民族醫學院附屬醫院神經內科收治的150 例ICAS 患者設為病例組，另選取同期健康體檢者150名設為對照組。納入標準：①病例組患者符合1995年全國第四屆腦血管病學術會議制定的ICAS 診斷標準[4]；②年齡＞55 歲；③臨床資料完善。排除標準：①急性心肌梗死、凝血障礙致腦梗死患者；②自身免疫性疾病及嚴重肝、腎功能不全患者；③有外科手術、急慢性感染、創傷等病史；④大動脈炎、顱內感染、血管畸形、心源性栓塞者；⑤造影劑過敏等腦血管造影禁忌者。病例組男90 例，女60 例；年齡60～76 歲，平均年齡（67.51±7.56）歲。對照組男77 例，女73 例；年齡59～74 歲，平均年齡（66.52±6.78）歲。兩組年齡、性別比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經右江民族醫學院附屬醫院倫理委員會批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 抽取受試對象空腹外周靜脈血1.5 ml，應用通用型動物基因組DNA 提取試劑盒（北京肇科新業生物技術有限公司）并嚴格按照操作說明書提取DNA，另應用紫外分光光度儀及瓊脂凝膠電泳檢測DNA 樣本純度，舍棄不合格的樣本。

1.2.2 引物設計及合成 在PubMed 中檢索IL-8 基因的全序列，選取IL-8 基因在-251A/T 位點為靶點，應用美國國家生物信息中心（NCBI）在線設計引物，通過上海生工生物工程有限公司合成引物，其上游引物為5-TGGCTGGCTTATCTTCACCATCA-3’，下游引物為5-TCAGGGCAAACCTGAGTCATCA-3’。

1.2.3 目的基因分型及測序 對選取的基因位點引物進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，PCR 反應在50 μl體系中進行，其中包括上、下游引物各2 μl，基因組DNA 1 μl，金牌Mix（green）45 μl，ddH20 補足50 μl。擴增條件：98 ℃預變性2 min；98 ℃10 s，54 ℃30 s，72 ℃30 s，重復30 個循環；最后72 ℃延伸1 min。對PCR 產物應用1%瓊脂凝膠電泳檢測其純度，并使用DNA 凝膠回收試劑盒對PCR 產物進行回收純化。應用ABI 公司DNA 測序儀（3730）測序，測序峰圖分析采用chromsa 軟件進行分析。

1.3 統計學方法 所有數據采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-8 基因-251A/T 位點基因分型 對IL-8 基因-251A/T 位點峰型圖分析，檢測到AA、AT、TT 三種基因型，見圖1。經Hardy-Weinberg 平衡檢驗分析發現，其符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡，所選樣本具有代表性。

圖1 IL-8 基因-251A/T 位點峰型圖

2.2 IL-8 基因-251A/T 位點等位基因與基因型頻率分析 兩組等位基因及基因型分布比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組IL-8 基因-251A/T 位點等位基因及基因型分布比較[n（%）]

2.3 病例組IL-8 基因-251A/T 位點與ICAS 易感性分析 與AT+TT 基因型相比，AA 基因型的ICAS 發病的易感性風險增加（OR=1.732，95%CI：1.013～2.961）。

3 討論

ICAS 是動脈粥樣硬化重要病因，動脈粥樣硬化除了進展緩慢外，也會脫落形成血栓，當堵塞重要腦供血區時，可能會危及生命。有研究表明[5]，ICAS 患病風險隨著年齡增加而增加。Lu M 等[6]研究發現,老年人群的頸動脈斑塊進展速度比年輕人群更快。ICAS 目前發病機理尚不明確，在眾多學說中，慢性炎癥學說越來越被臨床認可。

作為經典的炎癥趨化因子，IL-8 最早是由Yoshimur 通過刺激人單核細胞產生的具有中性粒細胞趨化功能的蛋白質[7]，其位于第4 號染色體，包含4 個外顯子和3 個內含子[8，9]。IL-8 主要是通過與受體結合，從而發揮生物學作用[10]，其與動脈粥樣硬化密切相關。An Z 等[11]研究顯示，在動脈粥樣小鼠中血清IL-8 水平較高。另外，鄭曉麗等[12]應用高脂動脈硬化模型檢測不同時期IL-8 的含量變化，結果發現在動脈粥樣硬化的早期IL-8 水平明顯升高。Kis Z 等[13]研究發現，IL-8 表達量在非心源性腦卒中患者中明顯高于健康人群。另外，Marino F 等[14]研究發現，在有頸動脈斑塊的患者中外周循環和斑塊內IL-8 均呈高表達。IL-8 促進動脈粥樣硬化機制是多方面的，其中Tang XE 等[15]研究發現，IL-8 通過增加miR-183 的表達，從而有效抑制膽固醇外流。應用IL-8 單克隆抗體可能為早期防治ICAS 提供了新的思路，Yang H 等[16]通過在兔動脈粥樣硬化模型中使用超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）傳遞IL-8 單克隆抗體，在進行靶向對比增強超聲檢查后發現，UTMD 傳遞的IL-8 單克隆抗體可減輕動脈粥樣硬化斑塊內的炎癥，提示UTMD 是一種新穎有效的斑塊穩定方法。隨著單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）逐漸興起，IL-8 基因多態性的研究也在不斷的深入，尤其是在腸炎、腫瘤等方面的研究[17]。但IL-8 基因多態性與動脈粥樣硬化的研究相對較少，尤其是IL-8 基因-251A/T 位于啟動子序列。

本研究通過分析病例組與對照組在IL-8 基因-251A/T 位點基因型與基因頻率，發現兩組在基因頻率分布及基因型分布均具有差異性，其中病例組純合子AA 基因型高于對照組，且病例組中AA 純合子能增加ICAS 發病的易感性，提示AA 基因型可能是ICAS 易感基因型。IL-8 基因-251A/T 位點位于啟動子序列，其可能通過調控基因轉錄，從而影響IL-8 蛋白的表達，促進動脈粥樣硬化形成，同時也證實了IL-8 基因-251A/T 位點基因多態性與動脈粥樣硬化密切相關，尤其是在冠狀動脈疾病方面。Zhang Q 等[18]研究發現，顯性（AA+AT vs TT）基因型模型IL-8 基因-251A/T 多態性與冠狀動脈疾病風險顯著相關（OR=1.48）。另外，Zhang X 等[19]研究發現，IL-8 基因-251A/T 多態性與急性冠狀動脈綜合征的敏感性增加相關（P=0.004，OR=1.30，95%CI：1.12～1.53），在急性冠狀動脈綜合征患者中IL-8 含量明顯升高，證實了IL-8 基因-251A/T 可能會影響IL-8 的表達。以上研究均提示，IL-8 基因-251A/T多態性與冠心病存在相關性。

綜上所述，IL-8 基因-251A/T 位點單核苷酸多態性可能與ICAS 發病易感性有關。