先天性無虹膜癥PAX6 致病基因分析及其分子診斷研究

魏譚偉

（武漢市普仁醫院眼科，湖北 武漢 430081）

先天性無虹膜癥（congenital aniridia）典型表現為虹膜組織部分或全部缺失或者高度發育不良，多為雙側發病，嚴重影響視功能，可伴有眼球震顫其他眼部并發癥，如先天性白內障、青光眼及角膜混濁等，同時無虹膜導致的眩光引起黃斑及其附近視網膜發育不良也會加重視功能受損。據報道[1]，先天性無虹膜癥的發生率為1∶70 000，20 歲以下人群中發生率高達1∶47 000，發病無種族及性別差異。先天性無虹膜癥的發病機制非常復雜，包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳，其中約1/3 為散發，2/3 有家族遺傳史，其中約85%為常染色體顯性遺傳，13%伴發于WAGR 綜合癥，該綜合癥表現為患者同時患有Wilms 腫瘤、先天性無虹膜、生殖器發育異常和智力發育遲緩，同時呈常染色體顯性遺傳；約2%為常染色隱性遺傳，常伴發于Gillespie's 綜合癥，表現為無虹膜、小腦共濟失調和智力發育遲緩[2]。先天性無虹膜癥主要與遺傳有關，其致病基因和基因突變位點相繼被發現。到目前為止，分子遺傳學的研究證明與先天性無虹膜癥有關的致病基因主要有PAX6 基因（人類配對盒基因，paired box gene，OMIM607108，GenBank：AH014790）、FOXCl 基因（叉頭框轉錄因子C1，forkhead box C1，OMIM 601090，GenBank：NM_001453）、PITX2 基因（OMIM601542，GenBank：KR710429）、FOXE3 基因（叉頭框轉錄因子 E3，forkhead box E3，OMIM601094，GenBank：NC_000001）、NF1 基因（神經纖維瘤蛋白1，neurofibromin 1，OMIM613113，GenBank：NC_000017）、OTX2 基因（鄰位齒狀同源盒基因，orthodenticle homeobox 2，OMIM600037，GenBank：NC_000014）等，約46 多個基因位點與先天性無虹膜癥有關。其中，最重要的的致病基因是PAX6 基因，80%～90%的先天性無虹膜癥與PAX6基因突變有關，它的很多基因位點已被定位，基因編碼蛋白質的致病機制也被闡明，這使先天性無虹膜癥的分子診斷成為可能，也為臨床基因靶向治療先天性無虹膜癥提供了理論基礎。本文就PAX6 基因及其分子診斷方法作一綜述。

1 PAX6 基因概述

人類PAX6 基因長22 Kb，共有14 個外顯子，位于11P13 位置，在眼、鼻、大腦、內分泌腺、中樞神經系統等的發育中發揮著關鍵作用，是眼部發育的主要控制基因。它的編碼產物屬于DNA 結合蛋白類，由配對盒結構域（paired domain，PD）和同源結構域（homeodomain，HD）組成，PD 結構域具有選擇性剪切功能，HD 結構域則可以調節下游基因表達，在功能上二者都屬于高度保守的轉錄因子，在眼部發育早期廣泛參與眼球各組織（包括視網膜、晶狀體、睫狀體、角膜、虹膜等）的正常發育和分化。而人類眼部發育是在多種轉錄因子（eye-field transcription factors,EFTFs）共同調控作用下進行的，所以當PAX6基因發生突變時可導致PAX6 整體蛋白活性降低大約50%，并使PAX6 單倍體劑量嚴重不足，最終引發各種眼部發育異常，其中最常見的是先天性無虹膜癥。先天性無虹膜癥患者多為PAX6 基因單獨突變，個別患者突變涉及PAX6 基因和相鄰的WT1 基因，表現為先天性無虹膜伴腎母細胞瘤、泌尿生殖系統異常和精神發育遲緩[3]。PAX6 基因突變有多種形式，與表型嚴重程度相關。迄今為止已發現三百余種突變，有20%～40%患者攜帶PAX6 基因大片段缺失，目前發現的主要突變PAX6 基因見表1。

表1 人類PAX6 基因突變

表1（續）

2 先天性無虹膜癥的分子診斷方法

遺傳病是現代醫學遺傳學研究的主要關注點，其中最重要的是尋找與研究人類致病基因。通過研究人類遺傳病可以將致病基因與臨床癥狀聯系起來，是闡明人類基因功能最重要的方法之一，而且目前通過對遺傳病致病基因的研究，可以了解這些基因對應的蛋白質的功能位點或功能區域，為未來基因遺傳病靶向治療提供理論基礎。有研究發現[38]，不同的分子遺傳性研究策略可發現無虹膜癥的致病基因，其中部分先天性無虹膜癥的主要致病原因是外顯子的缺失或基因拷貝數變化。多重連接探針擴增技術、實時定量PCR 技術及Southern 印跡雜交或熒光原位雜交等技術均可應用于基因拷貝數檢測或外顯子缺失[39]。

2.1 多重連接探針擴增技術（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）MLPA 是檢測DNA 大片段拷貝數異常的最新方法，具有高通量、操作簡單易行、可重復性高、結果簡潔等優點。MLPA的主要原理不是擴增DNA 靶序列，而是通過PCR擴增與DNA 靶序列雜交的探針，同時MLPA 的探針又攜帶了側翼序列，該序列可以通過攜帶熒光的通用引物進行PCR 擴增，使整個實驗過程只需要一對引物，就能達到同時擴增多個片段的目的。該實驗主要有4 個基本步驟：①DNA 變性及與MLPA 探針的雜交反應；②連接反應；③探針的PCR 反應；④擴增產物的毛細管電泳及數據分析。通過MLPA 技術可以提高檢測先天性無虹膜癥基因的拷貝數，可以發現PAX6 基因的大片段丟失，在外顯子測序未發現基因突變的患者中應用MLPA 檢測外顯子或基因片段單拷貝缺失可提高先天性無虹膜的分子診斷水平，提高臨床檢測先天性無虹膜癥家系突變基因的陽性率。

2.2 家系連鎖分析 在家系內，位于同一條染色體上2 個位點（致病基因與遺傳分子標記）在減數分裂的過程中會發生交換與重組，染色體上的2 個位點間相距越遠，發生遺傳重組的幾率越高，2 個位點在一起傳給后代的機會就越小。因此，可以利用家系中的遺傳分子標記與疾病位點間的重組率來估算兩者之間的距離及連鎖程度。位點間的距離的大小可以用重組分數進行估計，它通常用θ 表示，θ 定義為重組配子數與總配子數的比值，其取值范圍是0～0.5。計算連鎖程度，目前最常用的計算方法是優勢對數計分（lod score，LODS）法，LOD 值代表兩位點連鎖的機率與不連鎖的機率比的對數值，LOD 值大于3 表示肯定連鎖，LOD 值小于-2 表示否定連鎖，LOD 值介于-2 與1 之間則需增加家系材料。依據家系連鎖分析的定位候選克隆是以二代或二代以上的家系材料為基礎，對家系成員進行遺傳分子標記基因分型后，根據家系中成員提供的減數分裂事件，對致病基因所在的區域進行定位。家系連鎖分析對呈孟德爾遺傳、外顯率高的單基因遺傳病研究具有明顯的優勢。己有研究表明[40]，該方法是尋找致病基因重要的方法之一。當然，連鎖分析也有缺點，它需要完整的系譜材料，這就要求臨床盡可能對家系成員的樣本進行采集。另外在計算時，需要給出很多參數，如基因頻率、群體發病率、外顯率等，如果參數設定與實際情況不符合，則可能會得出錯誤結論。總之，家系連鎖分析可以提高先天遺傳性疾病候選致病基因的鑒定率，對先天性虹膜癥高危胎兒的產前診斷具有重大意義，有利于人類優生優育的發展。

2.3 外顯子組測序 外顯子組是一個物種基因組中全部外顯子區域的總和，該區域包含著合成蛋白質所需要的信息，涵蓋了與個體表型相關的大部分的功能性變異。外顯子組測序是以高效捕獲為前提，相對于全基因組測序，外顯子組測序的覆蓋度更深，數據準確性更高。目前，外顯子組測序不僅在孟德爾疾病[41]、歌舞伎面譜綜合征[42]、重型顱腦畸形[43]、家族低β-脂蛋白血癥[44]等研究中取得成功應用，還發現了一些新的致病基因突變。這些結果表明外顯子組測序可用于尋找單基因疾病、復雜疾病（如糖尿病、肥胖癥等代謝綜合癥）、甚至是癌癥的致病基因或易感基因，但在先天性白內障的研究中尚未得到應用。外顯子組測序是一種選擇基因組的編碼序列的高效策略，相對于全基因組測序成本較低，它只對基因組的約1%測序，更加經濟、高效，在相同預算情況下，可提供更高深度測序；同時它可以用來發現外顯子區的絕大部分的疾病相關變異，以及常見變異和頻率＜5%的低頻突變。因此，對某種特殊類型及遺傳方式復雜的遺傳病，外顯子組測序是一種更好的嘗試，例如檢測阿爾茨海默病風險相關的apoE4基因中的突變就是將內含子中的一部分插入了蛋白[45]，這是其他檢測手段無法發現的。綜上，通過外顯子測序可以提高無虹膜癥PAX6 基因突變的發現率，為臨床遺傳咨詢和產前診斷提供幫助。

3 總結

先天性無虹膜癥的分子診斷是基因靶向治療的前提，但目前仍面臨諸多困難，如先天性無虹膜癥的高度遺傳異質性、遺傳方式多樣性、致病基因PAX6編碼蛋白質的多樣性和臨床表現型的復雜性。隨著分子生物學的不斷發展，先天性無虹膜癥的基因診斷和基因靶向治療終將成為可能。