北蟲草水提物對小鼠酒精性肝損傷保護作用及機制*

王千慧，劉 穎，鄭劍玲，黃竹青，卜 桐，曲思吉，叢莉匯，韓桃桃，齊 賀

（遼寧省基礎醫學研究所遼寧醫藥職業學院醫學生物技術教研室，遼寧 沈陽 110101）

北蟲草（Cordyceps militaris），又稱為北冬蟲夏草，屬于子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocreales）蟲草科（Cordycipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）[6]。北蟲草中富含腺苷、蟲草素、蟲草酸、小分子肽等多種活性物質，具有良好的免疫調節、抗氧化、抗腫瘤、抗感染等藥理學作用[7-9]。

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是目前世界范圍內最常見的慢性肝病，同時也是我國最常見的肝臟疾病之一，其誘因為患者長期大量飲酒[1]。ALD初期通常表現為脂肪肝，進而發展成酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化；嚴重酗酒會誘發廣泛肝細胞壞死，甚至引起衰竭，嚴重危害身體健康[2-3]。ALD的發病機制包括導致肝臟脂肪變性、氧化應激，乙醇代謝中間產物乙醛介導的毒性以及細胞因子和趨化因子誘導的炎癥等[4-5]。

本課題組在前期研究中已發現北蟲草水提物對小鼠酒精性胃損傷具有保護作用，在此基礎上，以提升機體抗氧化能力、促進乙醇代謝，降低機體炎癥反應等因素為切入點，進一步探討北蟲草水提物對小鼠酒精性肝損傷保護作用及其機制，為拓展開發北蟲草相關產品提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

SPF級昆明小鼠，8周齡～10周齡，體重25 g～30 g，試驗動物生產許可證號：SCXK（遼）2015-0001，購自遼寧長生生物技術股份有限公司。雌雄各半分籠飼養，每日12 h光照，飲水自由。

1.2 試劑

超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）活性檢測試劑盒、乙醇脫氫酶（ADH）活性檢測試劑盒、乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測試劑盒，北京索萊寶生物科技有限公司；谷丙轉氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉氨酶（AST）試劑盒，南京建成科技有限公司；一抗、二抗及ECL發光試劑，武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器

ST8R高速冷凍離心機，美國賽默飛世爾公司；LGJ-10N凍干機，北京亞星儀科科技發展有限公司；K6600-A酶標儀，北京凱奧科技有限公司；Scientz-950E細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；Eclipse Ci-L正置白光拍照顯微鏡，日本尼康公司；BV-2垂直電泳儀、BT-2轉印電泳儀，武漢賽維爾生物科技有限公司；6300化學發光儀，上海勤翔科學儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 北蟲草水提物制備方法

采用低溫、高溫提取相結合方法。低溫提取溫度為 45℃，料液比 1∶30，提取 3 h，4 000 r·min-1離心10 min，分離得到上清液Ⅰ；再對沉淀進行高溫提取，溫度為80℃，料液比為1∶30，提取3.5 h后4 000 r·min-1離心10 min，得上清液Ⅱ；合并2次上清液旋轉蒸發進行濃縮，最后將濃縮液凍干得到粉末，置于-20℃冰箱中保存備用。使用時，用純化水進行溶解，現用現配[10]。

1.4.2 造模及給藥方法

將30只昆明小鼠隨機分成5組，每組雌雄各半。

陰性對照組：常規飼料，飲食自由，每日上午用蒸餾水（10 mL·kg-1）灌胃，3 h后再次采用蒸餾水（0.1 mL·kg-1）灌胃。

病理模型組：常規飼料，飲食自由，參照參考文獻[11-12]的造模方法和預試驗情況，每日上午用35%酒精（10 mL·kg-1）灌胃，3 h后用蒸餾水（0.1 mL·kg-1））灌胃。

北蟲草給藥組（3組）：常規飼料，飲食自由，每日上午用35%酒精（10 mL·kg-1）灌胃，3 h后分別用 0.5 g·kg-1、1.0 g·kg-1和 2.0 g·kg-1北蟲草水提物進行灌胃。

各組皆飼養14 d，末次灌胃后禁食不禁水，24 h后處死小鼠并立刻取材[10]。

1.4.3 小鼠血液樣本采集與血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶酶活性檢測

各組小鼠摘眼球取血，靜止2 h，3 500 r·min-1、4℃條件下離心15 min。取上清液，嚴格按照酶活性試劑說明書進行檢測。

1.4.4 小鼠肝組織相關酶活性及丙二醛含量檢測

將各組小鼠肝組織按0.1 g·mL-1加入相應提取液，于冰浴下勻漿，然后將勻漿液置于超聲波細胞粉碎儀中，功率200 W、超聲3 s，間隔10 s，重復30次破碎細胞。按各試劑盒說明書要求分別離心獲取各組小鼠肝組織上清液，分別測定各組小鼠肝組織上清液中超氧化物歧化酶SOD、乙醇脫氫酶ADH和乙醛脫氫酶ALDH活性及丙二醛MDA含量。

1.4.5 小鼠肝組織病理學檢查

小鼠肝臟用冷生理鹽水沖洗，剪取肝臟左葉用4%多聚甲醛溶液中固定，常規方法制作石蠟切片，采用蘇木精-伊紅染色法HE（hematoxylin-eosin staining，HE）進行染色并于光學顯微鏡下檢查組織病理學變化。

1.4.6 小鼠肝組織NF-κB和TNF-α蛋白表達水平

運用蛋白質印跡法檢測小鼠肝組織NF-κB（大小為65 KD），和TNF-α蛋白表達水平。用RAPI裂解液處理小鼠肝組織勻漿液30 min，4 000 r·min-1離心10 min后取上清。采用二喹啉甲酸法BCA（bicinchoninic acid assay，BCA）蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳，蛋白經電泳分離后轉移至PVDF膜上。采用脫脂奶粉封閉1 h后加入相應一抗（NF-κB和TNF-α），4℃孵育過夜。次日洗滌、室溫孵育二抗2 h，用凝膠成像儀成像、進行數據分析。

1.5 數據處理

研究數據均采用SPSS 13.0分析，所得數據均用平均值±標準差表示，多樣本間均值差異采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

北蟲草水提物對酒精性肝損傷小鼠血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性影響試驗結果（±s，n=6）見表1。

表1 北蟲草水提物對酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性影響Tab.1 Effects of Cordyceps militaris water extract on serum ALT and AST activities in mice with alcoholic liver injury

如表1所示，與對照組小鼠相比，病理模型組小鼠血清中谷丙轉氨酶ALT和谷草轉氨酶AST活性均明顯升高；與病理模型組相比，各濃度北蟲草水提物均能不同程度的降低小鼠血清中ALT、AST活性，且AST活性呈現濃度依賴性。

北蟲草水提物對酒精肝損傷小鼠肝組織超氧化物歧化酶SOD活性和丙二醛MDA含量影響試驗結果（±s，n=6）見表 2。

如表2所示，與對照組相比，模型組小鼠肝組織中SOD活性均明顯下降，而MDA含量明顯增高（P<0.01）；與模型組相比，各濃度組小鼠肝組織中的SOD活性增強，且存在濃度依賴性；同模型組相比，中濃度組和高濃度組小鼠肝組織中MDA含量明顯下降，具有統計學意義（P<0.05），而低濃度組則無明顯差異。

表2 北蟲草水提物對酒精性肝損傷小鼠肝組織SOD活性和MDA含量影響Tab.2 Effects of Cordyceps militaris water extract on SOD,GST and MDA of hepatic homogenate in mice of liver injury

北蟲草水提物對酒精肝損傷小鼠肝組織乙醇脫氫酶ADH和乙醛脫氫酶ALDH活性影響（±s，n=6）試驗結果見表3。

表3 北蟲草水提物對酒精性肝損傷小鼠肝組織ADH和ALDH活性影響Tab.3 Effects of Cordyceps militaris water extract on SOD,GST and MDA of hepatic homogenate in mice of liver injury

如表3所示，與對照組相比，模型組小鼠肝組織中ADH活性均升高（P<0.05）；與模型組相比，在分別給予北蟲草水提物后，小鼠肝組織中ADH、ALDH活性進一步升高，且存在濃度依賴性。

200倍鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理學變化，小鼠肝組織石蠟切片HE染色結果見圖1。

圖1 北蟲草水提物對小鼠酒精肝損傷組織病理變化的影響Fig.1 Effect of Cordyceps militaris water extract on alcoholinduced histopathological change

由圖1可知，對照組小鼠肝組織結構正常，肝小葉結構完整，肝索排列整齊，肝細胞胞質豐富、形態結構正常；病理模型組小鼠肝組織廣泛可見肝細胞脂肪變性，胞質內可見大小不一的圓形脂肪空泡（黑箭頭），可見較多肝細胞水腫，胞質疏松（白箭頭）；北蟲草水提物低濃度組與模型組小鼠相近，視野內可見肝細胞脂肪空泡、細胞水腫、胞質松散等情況，而中濃度組、高濃度組小鼠肝組織結構較為正常，雖可見散在脂滴，但肝索排列尚整齊，細胞形態較為正常，肝竇未見明顯擴張或擠壓，未見明顯炎癥。

各組小鼠肝臟組織中核轉錄因子NF-κB和腫瘤壞死因子TNF-α蛋白表達含量變化見圖2。

如圖2所示，與對照組相比，模型組小鼠肝組織中 NF-κB和 TNF-α蛋白表達明顯上調（P<0.05）；與模型組相比，給予北蟲草水提物后，小鼠肝組織中NF-κB蛋白表達下調，其呈現濃度依賴性低濃度北蟲草水提物對TNF-α蛋白表達量無明顯影響，中濃度和高濃度北蟲草水提物可使TNF-α蛋白表達量有所下降（P<0.05）。

圖2 北蟲草水提物對小鼠酒精肝損傷組織中NF-κB和TNF-α蛋白表達影響Fig.2 Effect of Cordyceps militaris water extract on the expression of NF-κB and TNF-α protein in alcoholic liver injury in mice

3 討論

酗酒是導致人類疾病與殘疾的三大危險因素之一，約有200余種疾病與過度飲酒相關，使癌癥風險上升[13]。肝臟是乙醇代謝的主要器官，乙醇代謝過程中，其本身及代謝產物如乙醇乙酸鹽、脂肪酸乙醇酯、乙醇蛋白復合物均會對肝組織造成直接或間接的毒性作用[14]。通過觀察病理切片可見：模型組小鼠肝細胞出現明顯病理變化，肝索結構紊亂，細胞界限、細胞核模糊不清，胞質疏松，有明顯的脂肪空泡，同時出現炎癥和壞死區；北蟲草水提物給藥組鏡下可見肝臟出現病理變化，但病變程度均較模型組輕，肝索排列尚整齊，細胞邊界、細胞核較為清晰，細胞內可見散在脂滴，有輕微炎癥和壞死區，表明北蟲草水提物具有肝臟保護作用。

ALT、AST是機體內2種十分重要的轉氨酶，臨床上常用血清ALT、AST活性反映肝細胞損傷程度。研究中發現病理組小鼠血清ALT、AST活性明顯升高，表明短期攝入高濃度酒精對小鼠肝細胞及細胞線粒體造成損傷；當給予不同濃度北蟲草水提物后，各組小鼠血清中ALT、AST活性明顯下降，同時各給藥組小鼠其肝細胞病理損傷程度均有所緩解，表明北蟲草水提物具有肝細胞保護作用。

機體氧化與抗氧化失衡時即產生氧化應激，目前大量證據表明氧化應激在酒精性肝損傷過程中發揮重要作用。乙醇經ADH代謝過程會增加還原性輔酶ⅠNADH（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）水平，增加了呼吸連中電子流；同時也可激活微粒體乙醇氧化酶系統（MEOS）和還原型輔酶Ⅱ NADPH（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH），產生大量活性氧（reactiveoxygen species，ROS），因此酒精代謝導致的氧化應激損傷可產生一系列級聯反應，使細胞內生物大分子和細胞器損傷、生物膜發生脂質過氧化、細胞內信號傳導通路改變、增加機體促炎細胞因子水平等[15-17]。SOD是機體抗氧化系統中最重要的酶類之一，對維持細胞與線粒體正常功能和結構完整性中起到重要作用[18]。MDA是脂質過氧化反應鏈式終止階段的產物之一，其含量多少可直接反映機體產生自由基的情況和組織細胞脂質過氧化程度。在研究中模型組小鼠肝組織中SOD活性較正常組小鼠明顯下降，而MDA含量卻顯著提升；當分別給予不同濃度北蟲草水提物后，各組小鼠肝組織中SOD活性均有所升高，MDA含量均降低，表明短期大量攝入酒精可引起小鼠肝組織氧化應激，機體抗氧化能力減弱、脂質過氧化水平升高，但北蟲草水提物可有效提高小鼠肝組織中SOD活性，降低MDA含量，提升機體抗氧化劑清除ROS能力，降低機體脂質過氧化水平，這也可能是北蟲草水提物拮抗小鼠酒精性肝損傷作用機制之一。

機體攝入酒精后，乙醇主要經肝組織ADH介導先氧化生成乙醛[19]；少部分乙醇則通過微粒體乙醇氧化酶轉化成乙醛，乙醛經ALDH氧化成乙酸，進入三羧酸循環，最終氧化成二氧化碳和水排出體外。因此當肝臟中ADH活性下降時，會導致機體乙醇蓄積，從而加重乙醇對肝、腦、腎等重要臟器的毒害作用[20-21]。研究中發現，給予酒精后，小鼠肝組織中ADH活性有所提高；當給予北蟲草水提物后，各組小鼠ADH活性進一步提高，表明北蟲草水提物可通過提高肝ADH活性，促進乙醇代謝，降低乙醇對肝臟的損傷和刺激作用，進而保護肝臟和其他重要臟器。

乙醛作為中間產物可直接觸發炎癥反應、細胞外基質重塑和纖維化，同時還可直接刺激肝星狀細胞中的轉化生長因子（TGF）-β信號轉導，進一步加重纖維化和炎癥作用，直接損傷肝組織[22-23]；此外乙醛還可與蛋白質、DNA共價結合，導致肝細胞中產生MDA，進一步加重肝損傷[24]。因此加速乙醛代謝對肝保護作用至關重要。研究中發現病理組小鼠肝組織中ALDH活性略微上升；當給予北蟲草水提物后，各組小鼠肝組織中ALDH活性明顯升高，呈現濃度依賴性，表明北蟲草水提物可通過提高機體肝組織ALDH活性促進乙醛代謝、降低乙醛對肝臟刺激和毒害作用，進而保護肝組織。綜上，北蟲草水提物可通過增強肝臟ADH、ALDH活性，加速乙醇、乙醛代謝，降低其對肝細胞毒性作用和肝臟負荷，進而發揮肝保護作用。

目前已有大量的研究表明NF-κB廣泛參與機體炎癥反應、免疫反應等基因表達調控，是機體內重要的炎癥轉錄調控因子[25-26]。正常情況下，其與抑制亞基IκB以復合物形式存在于細胞質中，當受到細胞外信號刺激時，如氧化應激刺激等信號，IκB被磷酸化并從復合物上解離下來，NF-κB迅速轉位至細胞核中并與特定的κB序列結合，調控包括TNF-α和IL-6在內的眾多炎癥因子的轉錄和表達[27-29]。

TNF-α是由機體內多種免疫細胞產生的具有重要生物活性的炎癥因子，目前與乙醇相關的肝組織疾病發病機制中，普遍認為最后共同通路由TNF-α介導，且已有研究發現TNF-α在酒精性肝損傷患者中過表達[30-31]。Masaki等[32]研究發現，對酒精性肝損傷大鼠給予抗TNF-α抗體或敲除TNF-α受體基因后，大鼠肝臟未出現炎癥及壞死情況。機體飲酒后造成氧化應激損傷，同時產生大量ROS，此時核轉錄因子NF-κB被激活，進而激活細胞外信號調節蛋白1/2（ERK1/2），早期生長反應因子-1（Egr-1）和蛋白激酶P38途徑，促使細胞產生大量TNF-α[33-35]。而TNF-α則通過多種途徑誘導了肝細胞凋亡，包括死亡受體通路及線粒體通路。在研究中發現，病理組小鼠NF-κB和TNF-α蛋白表達明顯上調，與病理組小鼠相比，北蟲草水提物各組小鼠NF-κB蛋白下調，且呈濃度依賴性；在中濃度、高濃度北蟲草水提物組中，小鼠TNF-α蛋白表達下調，表明北蟲草水提物可通過調控小鼠肝組織中NF-κB信號通路，抑制TNF-α釋放來避免肝細胞凋亡，保護肝組織。

綜上，北蟲草水提物具有良好的抗酒精所導致的氧化應激肝損傷作用，可幫助機體提高乙醇代謝能力，通過調節NF-κB信號通路，抑制TNF-α等炎癥因子釋放，從而發揮對酒精性肝損傷的保護作用。