不同生長階段甜靈芝產量及品質的比較研究*

李一凡，周振輝，陳東梅，黎 鋼，張 智

（廣東粵微食用菌技術有限公司，廣東 廣州 510663）

靈芝（Ganoderma spp.）來源于多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬（Ganoderma），具有養心安神、止咳平喘的功效[1]?，F代藥理學研究表明靈芝具有抗炎、抗腫瘤、降血壓、降血糖、免疫調節等藥理活性[2-4]。隨著靈芝顯著的藥效作用為大眾熟知，人們對靈芝的應用從治療病癥轉向預防和保??；使用切片的子實體煮水或煲湯，破壁孢子粉直接售賣或提取孢子油；相較而言，靈芝子實體更易獲得，且售價遠低于孢子粉加工產品。在民間使用最多的靈芝為赤芝（G.lucidum），但赤芝苦味重，大眾接受度差，這對靈芝子實體的推廣利用產生了一定影響。甜靈芝為1989年從日本引入的新品種[5]，其苦味較淡，味偏甜，口感優于赤芝，大眾接受度較佳，食用評價高于赤芝，具有很高的市場開發價值。據文獻報道，甜靈芝早期被認為屬于赤芝的變種[5]，但具體的品種鑒定結果以及該品種的拉丁名，至今未有報道。隨著分子生物學技術的發展，越來越多的研究者通過結合形態學與分子技術進行品種分類鑒定，以確定種屬及來源。近年來，隨著各方面研究的深入，大眾在生物學及生理學特性[6]、菌種制作[7]、培養方式[8-9]、功能成分分析[10]、木質素降解酶活性[11]等方面對甜靈芝有了更多的了解。其栽培、生產目前已初具規模，掌握不同生長階段的產量及品質可以更好地確定最佳采收時期及子實體開發方向，從而最大程度地提高菇農及企業的效益。通過分析、比較不同生長階段甜靈芝子實體的產量、多糖及三萜含量、孢子粉產量、收粉后子實體的品質等數據，以為甜靈芝的規模化栽培提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

所用甜靈芝菌株為廣東粵微食用菌技術有限公司保藏管（編號GL-AS）。由廣東省科學院微生物研究所食用菌研究中心進行分子鑒定，采用試劑盒法提取其DNA，以ITS序列為引物進行擴增，再結合其宏觀及微觀形態，結果表明該甜靈芝菌株為無柄靈芝（G.resinaceum）。

1.1.2 儀器與試劑

磁珠法真菌DNA提取試劑盒B，廣州邁寶生物科技有限公司；SHHL-1.2液壓翻斗培養料混合機、SZDY-1000食用菌培養料沖壓裝袋機，漳州市興寶機械有限公司；YXQ.WF22-800SZ臥式矩形壓力蒸汽滅菌器，湖南共創醫療設備有限公司；HK-C2D雙人垂直雙面潔凈工作臺，廣東環凱微生物科技有限公司；葡萄糖、蛋白胨，廣東環凱微生物科技有限公司；麩皮，五得利集團商丘面粉有限公司；高粱，本地超市采購；木屑，產自佛山南海；棉籽殼，產自廣州市白云區、新疆；碳酸鈣，產自廣州市白云區；17 cm×35 cm×0.005 cm聚丙烯折角袋，漳州天珍塑料制品有限公司。

1.1.3 培養基配方及制作

母種培養基：土豆200 g·L-1（去皮，切成小塊后水煮，過濾，濾液備用）、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂20 g·L-1、蛋白胨 5 g·L-1、硫酸鎂 1.5 g·L-1、磷酸二氫鉀 3 g·L-1、VB11 mg·L-1，pH 自然。

原種培養料：高粱98%（浸泡過夜，煮至無白心），碳酸鈣2%。

栽培種培養料及菌袋：木屑62%、棉籽殼27%、麩皮10%、碳酸鈣1%，含水量63%～65%，pH 6.2～6.4，每袋裝濕料1 kg。

1.2 試驗方法

1.2.1 發菌培養

將接種好的試驗菌袋放置在發菌房中黑暗培養，期間保證發菌房的環境參數為溫度22℃～24℃、濕度60%～70%、CO2體積分數0.2%～0.3%。在發菌期間觀測記錄試驗菇包的菌種萌發時間、長至袋肩時間、滿袋時間、袋間溫度以及其他生長情況。

1.2.2 出菇培養

待菌袋長滿白色菌絲且海綿蓋可見少量原基時在菌袋上開小口，之后立即移入出菇房中進行出菇生長情況觀測，管理參數在黃毅[12]、陳鋒平[13]的參數基礎上稍作調整。期間保證出菇房的環境參數為溫度26℃～27℃、濕度80%～90%、光照200 lx～600 lx；生長前期維持CO2體積分數0.1%～0.2%，待菌柄長至4 cm～5 cm時修枝，修枝后CO2體積分數降低至0.06%～0.08%，繼續培養。在出芝管理過程中記錄現蕾時間、菌柄長度變化、開傘情況。

1.2.3 采收

此菌株菌蓋為橢圓形，在開傘過程中，根據菌蓋大小設置3個生長階段（S1：菌蓋長直徑為4 cm～6 cm；S2：菌蓋長直徑為6 cm～8cm；S3：菌蓋長直徑為8 cm～10 cm）采收子實體，測定并記錄采收子實體的菌蓋長直徑及短直徑、鮮重及干重、含水量、三萜及多糖的含量。

1.2.4 孢子粉產量

當子實體邊緣的白色生長圈消失，菌蓋表面出現少量孢子粉時將其放入特定的收粉裝置中，進行孢子粉產量測定試驗，收粉裝置見圖1。

如圖1所示，收粉裝置為規格40.5 cm×40.5 cm×28.0 cm的紙箱，內固定規格為80 cm×70 cm×0.005 cm的聚丙烯袋，箱口處固定1層無紡布，再外置1層塑料膜，每個收粉箱內放置4個菌袋。收粉完成時，用小刷子將子實體及菌袋表面的孢子粉輕輕掃入聚丙烯袋中，剪下子實體稱重后，菌孔朝下放置在干凈的A4紙上，隔日觀察子實體是否繼續噴粉以判斷是否達到噴粉終點，收集的孢子粉稱重后測定其含水量。觀測并記錄不同收粉時間（30 d、35 d、40 d、45 d、50 d、55 d）的孢子粉產量及子實體情況，確定最佳收粉時間。

圖1 孢子收粉裝置Fig.1 Collecting device of spore powder

1.3 多糖和三萜的含量測定

子實體60℃烘干，干品參照《中國藥典》中靈芝多糖及三萜的測定方法進行含量測定[14]。

1.4 數據收集與分析

每個處理組觀測60包，重復3次。采用SPSS 20軟件進行數據統計分析，采單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan法進行差異顯著性測驗。

2 結果與分析

2.1 發菌情況

供試靈芝菌株發菌情況見表1。

表1 無柄靈芝菌絲體生長情況Tab.1 Mycelium growth Growth of Ganoderma resinaceum

如表1所示，接種后約3 d菌種萌發，7 d～8 d菌絲長至袋肩，18 d～20 d滿袋，后熟2 d～3 d出現原基頂蓋現象，可以進行出菇處理。在發菌過程中兩個菌袋間的溫度變化為22℃～25℃，菌絲長至袋肩時袋間溫度最高。

2.2 出菇情況

供試靈芝菌株出菇期生長情況見表2，開傘前及開傘后3個階段的子實體形態見圖2。

如表2、圖2所示，出菇培養后3 d～4 d現蕾，14 d～16 d菌柄長度約為4 cm，此時進行修枝，再繼續培養至開傘；22 d～23 d菌蓋的長直徑達4 cm～6 cm，26 d～27 d菌蓋的長直徑達6 cm～8 cm，29 d～30 d菌蓋的長直徑達8 cm～10 cm并出現輕微噴粉現象，子實體培養完成。該菌株出菇階段表現出原基數量較多、菌柄細長、噴粉時間較早的生長特點。

表2 無柄靈芝出菇情況Tab.2 Fruiting of Ganoderma resinaceum

圖2 不同生長階段的無柄靈芝子實體Fig.2 Fruit bodies of Ganoderma resinaceum at different growth stages

按照試驗設置的3個階段采收子實體，并對各項指標進行統計分析，結果見表3。

表3 開傘后不同生長階段的無柄靈芝子實體情況Tab.3 Fruit bodies of Ganoderma resinaceum at different growth stages after the pileus opening

由表3可知，在該培養條件下，菌蓋長直徑達到（9.37±0.46）cm，短直徑達到（7.62±0.66）cm時甜靈芝子實體基本成熟，開始出現輕微噴粉現象。對于子實體的產量而言，隨著子實體不斷長大，其質量不斷增加，但子實體含水量逐漸降低；子實體基本成熟時，平均單菇鮮質量為（30.86±1.70）g，含水量約77%。分析該甜靈芝子實體的三萜和多糖含量發現，隨著培養時間的增加，子實體的三萜含量不斷增加；在菌蓋生長至最大，子實體成熟時三萜含量達到最高，為（2.46±0.64）%。與之相反，其子實體的多糖含量隨著培養時間的增加不斷降低，在開傘初期多糖含量最高，為（1.14±0.11）%。由此可見，要想獲得三萜含量高的子實體，需要培養至成熟后再采收，而想要獲得多糖含量高的子實體，則需要在開傘初期采收。

2.3 孢子粉產量

當邊緣白色生長圈消失，出現輕微噴粉現象后將子實體放入收粉裝置中，跟蹤觀測不同采收時間的孢子粉產量及子實體情況，結果見表4。

表4 不同收粉時間的無柄靈芝孢子粉產量及子實體情況Tab.4 Spore powder yield and fruit body of Ganoderma resinaceum at different times for harvesting spore powder

由表4可知，隨著收粉時間的增加，孢子粉產量不斷上升；到第40天時孢子粉干重為16.36 g/袋，產量變化幅度達到最大；到第50天時雖然孢子粉產量最高（16.53 g/袋），但從第40天之后產量的變化幅度開始減小，且持續降低。孢子粉的含水量在收粉初期最高。收粉后子實體的單菇鮮質量逐漸下降，與子實體的干燥程度呈正相關，收粉50天后子實體較輕且質脆，與烘干后的靈芝相似。觀察發現收粉40 d時僅有極少數子實體可繼續產生少量孢子粉，結合時間、成本以及收粉末期會出現孢子粉顆粒不飽滿、品質差的情況，考慮孢子粉收集時間約40 d為宜，此時基本達到孢子粉采收的終點。

3 討論與結論

甜靈芝為商品名，目前市售甜靈芝可能存在品種混雜的情況。通過鑒定發現供試的甜靈芝品種為無柄靈芝。柯斌榕[15]曾對中國部分靈芝產區種質資源進行調查，結果發現目前栽培的靈芝品種主要有3類，包括赤芝菌株13個、紫芝（G.sinense）菌株1個、無柄靈芝菌株4個。由此可見，無柄靈芝早已被廣泛栽培和使用。盡管無柄靈芝與赤芝在形態上存在一定差異，但二者親緣關系十分接近，經常容易混淆[16]。對無柄靈芝的有效成分測定結果表明，無柄靈芝子實體內三萜含量較赤芝高[17]。此外，彭惺蓉[18]從無柄靈芝中分離獲得了18個化合物，主要為可能起到保肝作用的三萜類化合物。Ding等[19]對無柄靈芝三萜類化合物進行分析，發現其含有試驗中作為標準品參照所用的8種靈芝酸?？梢姛o柄靈芝內三萜類化合物豐富，作為子實體推廣或保健品原材料進行開發利用，均具有很好的潛力。

供試甜靈芝子實體的三萜含量隨著培養時長的增加而不斷上升，但多糖含量隨著培養時長的增加而降低，這與林應興[20]、付立忠[21]等對赤芝的研究結果相一致，說明此甜靈芝菌株與赤芝有相似的生長規律。相較而言，甜靈芝在三萜含量上較其他靈芝菌株（霍芝1號、韓芝、日芝）更具優勢[22]，因此更適合用于提取三萜類成分。

在收粉40天后此甜靈芝菌株基本已達到了噴粉終點，且子實體較干燥，考慮到成本問題，甜靈芝的收粉時間建議以40 d～50 d為宜。此外，該甜靈芝菌株的噴粉時間較早；且相較于已被報道的其他靈芝菌株（龍芝二號、滬農一號、南韓靈芝、美國大靈芝、中華紅芝等）[23-24]，此菌株孢子粉產量較大，收粉時間適宜；因此該甜靈芝也可以作為一個收粉的品種進行開發利用。

在目前關于無柄靈芝的研究中，暫未發現有關其味道偏甜的報道，此甜靈芝菌株可能為無柄靈芝里較為特殊的一個品種。無柄靈芝與赤芝的親緣關系十分接近，并具有相似的生長規律，且在三萜種類及含量上較赤芝有一定的優勢。此外，此次供試菌株作為無柄靈芝中的一種，在孢子粉產量上也具有很好的表現，說明無柄靈芝也具有開發成產孢靈芝的潛能。雖然目前無柄靈芝已被廣泛栽培，但因未被列入《中國藥典》而導致其在加工利用中受到一定的限制，因此，推動該品種進入新食品原料名錄對更充分地利用無柄靈芝的優勢、豐富靈芝栽培產業及靈芝保健品行業都具有重要的意義。