適用于食用菌擔子結構觀察的冷凍切片技術*

余秋雨，嚴 冬，劉 宇，王守現，高 琪

（1.北京市農林科學院植物保護研究所，北京 100097；2.東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620）

食用菌子實體的形成和發育機制是近年來食用菌領域的研究重點。從細胞生物學層面對子實體結構進行觀察是研究子實體形成、發育最為有效和直觀的方法[1]。雜交育種是目前食用菌新品種選育的主要方法，明確擔孢子的核相和有性生活史是擔子菌開展雜交育種的基礎[2-3]。孢子內的細胞核數直接影響擔子菌的有性生殖模式[4]，解析擔子中細胞核的行為從而明確擔孢子中的核數，不僅是研究擔子類食用菌有性生活史的基礎，而且對開展食用菌新品種的育種工作來說也極有必要。

便捷的連續切片及亞細胞結構定位技術，有助于通過細胞顯微結構觀察食用菌擔子結構及其細胞核變化規律。常用的切片方法有徒手切片法、石蠟切片法和冷凍切片法等。徒手切片法是進行動、植物組織顯微觀察時最實用的方法之一，其不需要專門的儀器設備和特殊化學試劑（脫水劑、包埋劑等）處理。但觀察效果與樣品處理后的軟硬程度和切片的形態密切相關，且在制片過程中樣品的組織結構易被破壞，難以得到薄而完整的切片[2]。例如常用的刀片壓切法，將樣品組織夾在兩塊刀片間壓切，得到的切片往往破損較多，有些含海綿組織較多的樣品，在海綿組織受壓復原時會因吸入空氣而使顯微視野下出現氣泡，嚴重影響觀察結果[5]。由此可見，該方法對操作者的技術要求較高。石蠟切片法已廣泛應用于動、植物組織的顯微觀察中，在大型真菌如雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、黑木耳（Auricularia auricula）和橘黃裸傘（Gymnopilus spectabilis）等子實體的研究中也有應用[6-8]。但石蠟切片法的步驟多、耗時長，所使用的試劑如二甲苯毒性較大，會對操作者的身體健康造成一定影響[9]。另外，在石蠟切片染色過程中食用菌材料不易著色[10]，高溫融蠟這一操作極易導致樣品組織結構和染色體的損傷，并且石蠟自發熒光的干擾會使其不適于熒光染色以進行一些其他的免疫熒光染色觀察[11]。

冷凍切片法，是將樣品組織置于低溫條件下，待其硬度達到一定要求時進行切片。與常規的石蠟切片法相比，冷凍切片的制作過程無需脫水、透明和浸蠟等操作，不會因高溫融蠟而造成樣品組織的損傷，可保持樣品原有的形態，常用于原位雜交、組織化學和免疫定位等研究[12-13]。李建霞等[12]以毛白楊的子房組織為例，優化了直接包埋冷凍切片技術的冷箱溫度、冷臺溫度和冷凍時間，獲得了較好的切片，并在其他植物組織上驗證了該方法的普適性。張力平[14]根據工作經驗和試驗，改良固定液成分，探索出一套適用于植物病原真菌的冷凍切片技術。姚娟妮等[15]將冷凍切片技術用于植物病原菌侵染的預檢。由于不同種類的樣品組織具有不同的性質和特點，相應的冷凍切片制備方法也存在一定差異。食用菌的子實體和菌絲體較軟，尤其是子實體的菌褶部分較小、易碎且含水量高，常規切片耗時長、操作復雜，不能滿足食用菌顯微結構觀察的試驗需求。鑒于冷凍切片具有操作便捷、用時短、組織完整性好等優點，對冷凍切片技術進行優化，建立高效且適用于食用菌組織的冷凍切片技術，以期為食用菌的分類鑒定、有性生活史研究和新品種的選育提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

絲球小奧德蘑（Oudemansiella apalosarca）菌株JZB-2115055、香菇（Lentinula edodes）菌株JZB-2102217和平菇（Pleurotus ostreatus）菌株 JZB-2101390，由北京市農林科學院植物保護研究所食用菌研究室提供。

1.1.1 栽培料配方

絲球小奧德蘑栽培料：棉籽殼50%、木屑30%、麩皮18%、石灰2%，含水量60%～65%；香菇栽培料：木屑78%、麩皮20%、石膏1%、葡萄糖1%，含水量50%～55%；平菇栽培料：棉籽殼39%、玉米芯39%、麩皮20%、石灰2%，含水量60%～65%。

1.1.2 主要試劑與儀器

海藻糖、甘油、蔗糖、0.1 mol·L-1KH2PO4、0.1 mol·L-1Na2HPO4·12H2O、 0.001 9 mol·L-1NaH2PO4·2H2O、0.008 1 mol·L-1Na2HPO4·12H2O，購自國藥集團化學試劑有限公司；冷凍切片組織包埋劑，購自Leica公司；4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI），購自Sigma公司；戊二醛固定液（2.5%戊二醛），多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛），購自Solarbio公司。

CM1950冷凍切片機，Leica公司；IX71熒光倒置顯微鏡，Olympus公司。

1.2 試驗步驟

1.2.1 固定

用鑷子選取絲球小奧德蘑的菌褶組織，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2次，加入含有不同成分的固定液，于4℃下固定，棄液體，得到固定好的樣品。對照組不加固定液。不同固定方式及分組見表1。

表1 絲球小奧德磨的菌褶組織的不同固定方式Tab.1 The different fixation method for Oudemansiella apalosarca gill

1.2.2 預處理

將固定好的樣品用PBS清洗2次～3次后，設置5個分組（P1～P5）進行預處理。P1：海藻糖5%、甘油10%，室溫孵育1 h；P2：海藻糖10%、甘油5%，室溫孵育1 h；P3：蔗糖20%和甘油10%，室溫孵育1 h；P4：分別按照30%、40%、50%、60%、70%的乙醇梯度水溶液順序進行處理，各梯度均處理10 min；P5（CK）：對照，不進行預處理。P1～P4進行預處理后棄去液體，得到預處理的樣品。

1.2.3 包埋

將樣品托放至樣品準備臺，-10℃預冷5 min，預冷后利用冷凍切片包埋劑進行逐層包埋，直至樣品全部被包埋，在樣品臺上繼續冷凍直至包埋劑凝固。

1.2.4 切片

用冷凍切片機進行切片。箱體和冷刀溫度設定為-20℃，將包埋好的樣品固定在樣品臺上，將樣品表面修飾平整后，設置6個分組（T1～T6）進行切片。T1：切片厚度為4 μm；T2：切片厚度為6 μm；T3：切片厚度為8 μm；T4：切片厚度為 10 μm；T5：切片厚度為12 μm；T6：切片厚度為20 μm。

1.2.5 制作顯微玻片

切片完成后，用毛筆挑取切下來的材料放置于載玻片上，用ddH2O清洗2次，去除殘留的包埋劑，晾干得到干凈的載玻片。

1.2.6 品紅染色試驗

向潔凈的載玻片上滴加品紅染液，將蓋玻片蓋于染色區域，在蓋玻片四周涂抹指甲油封片，將載玻片置于顯微鏡下進行觀察。

1.2.7 熒光染色試驗

使用干凈的載玻片，在需染色區域滴加30 μL DAPI染色液，將蓋玻片蓋于染色區域，四周涂抹指甲油封片，冰盒內靜置1 h。將載玻片置于熒光顯微鏡下，在激發波長405nm、發射波長488nm下進行觀察。

1.2.8 技術適配性驗證

采用改良后的冷凍切片技術分別對平菇子實體、香菇子實體和香菇菌絲體等材料進行切片。在顯微鏡下觀察切片效果，驗證該技術在食用菌領域的適配性，并優化不同食用菌組織材料的最適切片厚度。

2 結果與分析

2.1 固定條件優化結果

各組樣品使用不同固定方法進行固定，之后均添加海藻糖5%、甘油10%作為冷凍保護劑進行相同預處理，統一設置切片厚度為12 μm。不同固定方式對切片的影響見圖1。

圖1 不同固定方法下絲球小奧德蘑的冷凍切片Fig.1 Freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca under different fixation methods

如圖1所示，與固定后的樣品相比，對照組F5（CK）組織細胞破損嚴重，且擔子細胞輪廓不清晰，無法觀察到完整的細胞形態。經過固定的樣品（F1～F4），細胞結構相對完整、清晰。與F1（戊二醛固定液固定）的樣品相比，F2（多聚甲醛固定液固定）的樣品有少部分組織仍易出現破損情況。F1固定20 min后，樣品的擔子細胞輪廓清晰且結構完整，可滿足大部分光學染色和熒光染色需要。F3和F4切片結果顯示，菌褶組織固定時間超過1 440 min時，組織可完全浸入固定液中，但都會對細胞組織造成嚴重破壞，影響組織的完整性。

2.2 預處理條件優化

不同預處理條件對切片的影響見圖2。

如圖2所示，P5（CK）未經預處理的組織細胞破碎，損傷嚴重。P4（酒精梯度脫水）的樣品，細胞內失水嚴重，造成孢子大面積皺縮損傷。P3（蔗糖20%、甘油10%預處理）的樣品，其組織在一定程度上保持了完整性，但擔子細胞失水皺縮嚴重，細胞界限不清晰。P2（海藻糖10%、甘油5%預處理）的樣品，其擔子細胞界限清晰明顯，但海藻糖濃度過高仍會導致擔子細胞失水皺縮。P1（海藻糖5%、甘油10%預處理）的樣品，其擔子細胞界限明顯清晰，無失水皺縮現象，便于顯微結構觀察。

圖2 不同預處理條件下絲球小奧德蘑的冷凍切片Fig.2 Freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca under different pretreatment methods

2.3 絲球小奧德蘑擔子觀察的最適切片厚度

按照設定的不同切片厚度（T1～T6）進行切片后，發現T1（切片厚度4 μm）和T2（切片厚度6 μm）的切片中部破損嚴重，有較大空隙，因此后續只對T3～T6的切片進行品紅染色觀察，結果見圖3。

圖3 不同厚度的絲球小奧德蘑冷凍切片Fig.3 Freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca with different thicknesses

如圖3所示，品紅染色后絲球小奧德蘑的擔子及菌絲輪廓更加清晰，便于觀察。對比觀察結果發現，T3～T5（切片厚度為 8 μm～12 μm）處理下觀察結果最為理想；切片厚度越薄，菌褶中心部菌絲組織越容易破碎；T6（切片厚度為20 μm）易出現多層擔子細胞現象。因此，觀察絲球小奧德蘑單個擔子細胞內情況時，最適切片厚度為8 μm；觀察整體菌褶組織情況時，最適切片厚度為12 μm。

2.4 熒光染色效果

對絲球小奧德蘑冷凍切片進行熒光染色，觀察結果見圖4。

圖4 絲球小奧德蘑冷凍切片熒光染色Fig.4 Fluorescent staining of freezing microtome section of Oudemansiella apalosarca.

如圖4所示，通過使用DAPI染色液進行熒光染色，可清晰觀察到絲球小奧德蘑菌褶中完整的孢子、菌絲、擔子細胞組織結構，以及其中的細胞核，而且信噪比較高，表明該技術可以應用于熒光染色核相分析。

2.5 改良后冷凍切片技術在食用菌中適配性

利用條件優化的冷凍切片技術，選取戊二醛為固定液，固定時間為20 min，添加海藻糖5%、甘油10%作為冷凍保護劑進行預處理，對不同的食用菌品種及部位進行切片，結果見圖5。

如圖5所示，改良后的冷凍切片技術適用于平菇的子實體（圖5A）、香菇的子實體（圖5B）及菌絲體（圖5C）。由于不同種類的食用菌擔子大小及菌絲直徑存在差異，因此不同種類的食用菌最適切片厚度不同，其中成熟的平菇子實體菌褶中擔子觀察適宜切片厚度為6 μm～8 μm，可觀察到菌褶中菌絲和擔子完整形態結構。成熟香菇子實體及次生菌絲體觀察的適宜切片厚度為4 μm～6 μm。

3 討論與結論

組織切片是從細胞生物學層面對食用菌子實體結構進行觀察研究的最為有效和直觀的方法之一[1]。常用的組織切片方法有徒手切片法、石蠟切片法和冷凍切片法等，其中徒手切片法對操作者的技術要求較高；石蠟切片法步驟多、耗時長，樣品組織結構易受損[9]。冷凍切片法操作較簡單、耗時短，可保持樣品原有的生活形態，檢測結果較準確，可用于原位雜交、組織化學和免疫定位等多種研究[12]。自1891年被確定為正式的診斷方法以來，冷凍切片成為臨床上幫助醫生確定疾病性質的一種可靠手段，在疾病診斷中廣泛應用[15]。近年來，冷凍切片技術被逐步應用到植物研究中，多用于觀察植物器官結構，如高度木質化材料、植物花器官、植物微管骨架以及植物組織化學方面[15]。謝佩松等[16]利用冰凍切片技術，對草本植物水稻和麥冬的根、莖、葉進行了冰凍切片，觀察其顯微結構和木質素的顯微化學定位，獲得了高質量的圖片。朱登峰等[17]研究發現，快速冷凍切片法處理的植物細胞結構保存較好，木質素染色清晰，且操作方法簡便、快速、有效。寧代鋒等[18]建立了一種直接包埋冷凍和適當回溫相結合的方法，不僅可以制作出植物細胞基本結構保存完整的組織切片，而且避免了使用冰凍保護劑的弊端。

目前對食用菌的切片觀察大多使用其他的切片法。萬佳寧等[11]運用包埋切片法制備了草菇（Volvariella volvacea）子實體不同發育時期的菌褶切片，并運用熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡清晰觀察到草菇擔子細胞中的核相以及在減數分裂中的變化等。王瑞娟等[9]運用改良石蠟切片法制備了金針菇（Flammulina velutiper）子實體不同發育時期的切片，觀察其菌褶和菌柄的細胞結構，發現以檸檬烯為透明劑時金針菇子實體組織結構清晰、完整、無皺縮。萬佳寧等[19]通過優化石蠟切片方法對香菇子實體發育初期組織結構進行觀察，結果表明Van-Clear為最適透明劑，以其制備的石蠟切片中香菇子實體各部分組織結構清晰、完整、無皺縮變形。張鵬[8]通過石蠟制片法制片觀察木耳（Auricularia auricula）內部結構。酒連娣[20]運用石蠟切片和徒手切片相結合的方法，對亞側耳（Panellus serotius）原基到成熟子實體各階段的材料進行解剖研究。而使用冷凍切片技術對食用菌顯微結構進行觀察的報道較少，分析其主要原因可能是食用菌組織，尤其是菌褶部分易碎且含水量高，常規的冷凍切片方法并不適用于食用菌組織切片。

因此，此次針對食用菌的材料特點建立一種適用于食用菌擔子結構觀察的冷凍切片技術，經驗證可成功應用于絲球小奧德蘑、平菇和香菇子實體。該冷凍切片技術條件為：選取戊二醛為固定液，固定20 min，添加海藻糖5%、甘油10%作為冷凍保護劑進行預處理。切片厚度應根據不同的食用菌品種稍加調整，絲球小奧德蘑子實體切片厚度的選擇范圍為8 μm～12 μm，平菇子實體切片厚度的選擇范圍為6 μm～8 μm，香菇子實體及菌絲體切片厚度的選擇范圍為4 μm～6 μm，此時有助于獲得質量較高的組織切片。該技術具有無毒、快速、操作簡便、切片厚度薄、可用于免疫研究等優點，可顯著提高食用菌組織切片的質量，為食用菌的細胞結構觀察提供有力支持，為食用菌育種研究提供有效的方法保障。