硬毛粗蓋孔菌YM11菌株的分離鑒定與馴化栽培*

唐少軍，許 雋，楊 祎，任 銳，邵晨霞，吳勝蓮，喻桃生

（1.湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009；2.湖南湘蕈生物科技有限公司，湖南 長沙 410009）

大型真菌是藥物活性物質的重要來源，1969年日本科學家田池等[1]發現香菇（Lentinus edodes）中的提取物對小鼠體內腫瘤有抑制作用，從此拉開了對食（藥）用真菌研究的序幕。隨著不斷的探索，大量食（藥）用真菌被制作成抗癌藥物，目前已經有50多種用于加工[2-5]。大型藥用真菌相較于西藥，具有療效長、對身體損害小的優點，近幾年引起了醫藥界的高度關注。因此，挖掘藥用真菌資源對開發活性藥物或藥物先導分子具有重要的意義。

硬毛粗蓋孔菌（Coriolopsis trogii）是一種重要的大型藥用真菌，隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）革孔菌屬（Coriolopsis）[6]，也被命名為Trametes trogii[7]、Funalia trogii[8]，是一種生長在溫帶的木腐菌，常見于楊樹和柳樹上，我國東北、華北、內蒙古、西北、華中等地均有分布[9]。硬毛粗蓋孔菌含有多種生物活性物質，能分泌纖維素酶、過氧化物酶和漆酶，有較強的木質素降解能力[10-11]，可對工業廢水進行脫色，同時還能吸附Hg2+、Cd2+和Zn2+等重金屬離子，有環境修復功能[12]；其野生子實體粗提物有提高免疫[13]、抗氧化[14]、保肝[15]、抗腫瘤[16-17]等多種活性，有重要的藥用價值。然而，目前對硬毛粗蓋孔菌的系統鑒定、生物學特性分析與栽培應用的報道較少。通過分離鑒定得到一株野生硬毛粗蓋孔菌，首次開展其馴化栽培及抗腫瘤活性試驗，豐富了硬毛蓋孔菌的資源，并為該菌株的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

野生菌株子實體樣品采自山東省青島市502省道路邊的柳樹上，參照參考文獻[17]的方法，對野生菌實體進行組織分離，得到供試菌株YM11。

1.2 試劑和儀器

主要試劑：葡萄糖、酵母粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4、ZnSO4·7H2O均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乙酸乙酯、乙醇，北京化工廠；宮頸癌細胞（Hela）、人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC），中國典型培養物保藏中心（China center for type culture collection，CCTCC）。

GYM固體培養基配方：葡萄糖 30 g·L-1，蛋白胨 15 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，KH2PO41.5 g·L-1，瓊脂粉 15 g·L-1，pH 6.5。

主要儀器：IX51倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；N-1000v-W型旋轉蒸發儀，瑞士步琦公司；酶標儀，美國伯樂公司；ST 16 R型離心機，美國賽默飛世爾公司；MCO-15AC型CO2培養箱，日本三洋公司；Milli-Q水純化系統，美國默克公司；EVO 10掃描電鏡，德國蔡司公司；S8APO體式顯微鏡，德國徠卡公司。

1.3 YM11菌株的形態鑒定

75%酒精消毒子實體表面，用無菌手術刀切開子實體，在中心位置挖取黃豆大小的子實體，置于GYM固體培養基中，26℃條件下培養。菌絲萌發后轉接至試管培養基中保藏菌株，菌株編號YM11。參照參考文獻[18]的方法，利用掃描電鏡觀察YM11菌株的菌絲形態和孢子形態，利用體式顯微鏡觀察子實體的表面和內部特征。

1.4 YM11菌株的分子鑒定

利用真菌基因組試劑盒提取YM11菌株的基因組。以提取到的基因組為模板，采用通用引物對ITS1/ITS4（5′-TCCGTAGGTGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），對該菌株的 ITS序列進行PCR擴增。反應體系30.0 μL含10×PCR Buffer 5.0 μL、dNTP 3.0 μL、正向引物 1.0 μL、反向引物 10 μL、DNA 模板 2.0 μL、Taq DNA 聚合酶2 U，以無菌去離子水補足至30.0 μL。擴增程序參照參考文獻[19]。將PCR擴增產物連接至pMD18-T載體，轉入大腸桿菌菌株top10后，提取陽性質粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序得到的序列在NCBI數據庫上進行Blast比對，從中獲取與供試菌株親源關系較近的模式菌株ITS序列，運用MEGA 3.1和Clustal X 1.81，采用鄰接法（N-J）構建系統發育（重復次數Replications=1 000，自舉Bootstrap值取百分比）。

1.5 YM11菌株的生物學特性分析

1.5.1 不同碳源對菌絲生長的影響

培養基配方為GYM固體培養基配方，試驗碳源30 g·L-1，其他成分含量一致。試驗碳源分別采用葡萄糖、玉米粉、蔗糖、可溶性淀粉、麩皮、乳糖、大米粉、土豆粉。以不加碳源為對照，每組3個重復。使用打孔器將一個直徑約1.1 cm的菌塊接種于培養皿（直徑9 cm）中央，25℃培養箱中培養10 d，觀察菌絲長勢，采用“十”字交叉法每天測量菌落直徑，并計算菌絲平均生長速度。

1.5.2 不同氮源對菌絲生長的影響

培養基配方為葡萄糖GYM固體培養基配方，試驗碳源15 g·L-1，其他成分含量一致。試驗氮源分別采用酵母粉、蛋白胨、谷氨酸、牛肉膏、硝酸鉀、尿素、草酸銨。以不加氮源為對照，每組3個重復。使用打孔器將一個直徑約1.1 cm的菌塊接種于培養皿（直徑9 cm）中央，在25℃培養箱中培養10 d，觀察菌絲長勢，按1.5.1的方法測定菌絲平均生長速度。

1.5.3 不同溫度對菌絲生長的影響

用打孔器將一個直徑約1.1 cm的菌塊接種于GYM固體培養基（直徑9 cm）中央，分別于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃培養箱中培養10 d。每組3個重復，觀察菌絲長勢，按1.5.1的方法測定菌絲平均生長速度。

1.5.4 不同pH對菌絲生長的影響

以稀鹽酸和稀氫氧化鈉溶液調節GYM培養基pH梯度，分別為4、5、6、7、8、9，使用打孔器將一個直徑約1.1 cm的菌塊接種于GYM固體培養基（直徑9 cm）中央，每組3個重復，25℃培養箱中培養10 d，觀察菌絲平均長勢，按1.5.1的方法測定菌絲平均生長速度。

1.6 YM11菌株的馴化栽培

設計了3種栽培種培養料配方進行對比試驗，配方如下。

A：木屑75%、棉籽殼10%、麩皮10%、葡萄糖4%、石膏1%，含水量60%～65%；

B：木屑75%、棉籽殼10%、麩皮10%、玉米粉4%、石膏1%，含水量60%～65%；

C：木屑75%、棉籽殼14%、麩皮10%、石膏1%，含水量60%～65%。

采用17 cm×33 cm×0.04 cm規格的聚丙烯塑料栽培袋，將上述攪拌均勻的培養料裝入袋中，每袋0.9 kg，料面壓平后套塑料環和封口蓋。袋料于121℃滅菌4 h，冷卻至26℃以下接種。每袋接入4 g菌絲塊，接種后于26℃避光培養。待菌絲長滿袋后，轉移至出菇房，用手術刀在栽培袋的側邊橫向劃4 cm口進行催蕾。出菇期間，溫度為24℃～26℃，相對濕度85%～95%，每天提供1 000 lx～1 500 lx散射光3 h～5 h。子實體采收后計算產量和生物學效率。

1.7 栽培子實體粗多糖的制備

取2 kg硬毛粗蓋孔菌子實體40℃條件下烘干，將烘干的子實體研磨后經200目濾網得到子實體粉末，向粉末中加入蒸餾水，然后在95℃條件下浸提24 h，得到的濾液經減壓濃縮得到水提物。參照參考文獻[20]，用Sevag法除蛋白后將溶液緩慢加入4倍體積的無水乙醇中，4℃條件下靜置8 h～10 h，然后在10 000 r·min-1、4℃條件下離心10 min后收集底部沉淀，收集到的沉淀經過冷凍干燥后得到粗多糖。

1.8 栽培子實體粗多糖的抗腫瘤活性

將粗多糖用無菌水配制成不同濃度梯度（0、0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1），分別經0.22 μm濾膜過濾后備用。在96孔板接種腫瘤細胞Hela、MCF-7和Hep-3B，每孔接種100 μL體積的細胞懸液（含5×103個細胞），置于37℃、5% CO2的培養箱中。待細胞貼壁后，分別加入10 μL不同濃度的粗多糖，以無菌水為空白對照，培養24 h觀察細胞形態的變化，并參照參考文獻[21]的方法計算細胞抑制率。

2 結果與分析

2.1 YM11菌株的形態鑒定

樣品子實體形態見圖1。

圖1 YM11菌株子實體和菌絲生長情況Fig.1 Fruit body and mycelium growth situation of strain YM11

如圖1所示，子實體附生于柳樹上，子實體無柄，覆瓦狀生長，木質結構，菌蓋外伸12 cm～16 cm，菌肉厚3 cm，子實體上下表面顏色一致，有肉眼可見的粗毛結構，分離子實體得到的菌絲在GYM固體培養基上呈白色，由中心向四周輻射生長。

用體式顯微鏡（15×）觀察YM11菌株子實體的表面特征，結果見圖2。

如圖2所示，子實體下表面有密集的孔口，孔口呈黃褐色，每毫米2個～4個，邊緣呈鋸齒狀；子實體上表面呈黃褐色，有較密的硬毛生長；子實體縱切面結構較松散，有明顯的微管，與菌肉同色，微管內可見白色菌絲。

圖2 顯微鏡下YM11菌株子實體形態特征Fig.2 Morphological fruit body characteristics of strain YM11

用掃描電鏡觀察YM11菌株微觀結構，結果見圖3。

圖3 掃描電鏡觀察YM11菌株的顯微形態Fig.3 The micromorphology of strain YM11 observed by SEM

如圖3所示，菌絲在萌發階段，菌絲較光滑，菌絲結構有分枝，無隔膜，菌絲在老化階段，菌絲較萌發階段更粗且不光滑。孢子呈圓型，直徑2 μm～3 μm，表面有明顯的小刺，形態基本符合硬毛粗蓋孔菌的特征。

2.2 YM11菌株的分子鑒定

YM11菌株ITS序列長度為681 bp，將其在NCBI數據庫中進行Blast比對，發現與硬毛粗蓋孔菌C.trogii（MG779615.1）的ITS序列最為接近，見圖4。選取與YM11菌株序列比對相似性較高的其他ITS序列構建了系統發育樹，結果也與硬毛粗蓋孔菌在一個分支，表明YM11與硬毛粗蓋孔菌為同一物種。但Blast比對結果顯示YM11菌株ITS序列與硬毛粗蓋孔菌C.trogii（MG779615.1）最高相似性僅為98%，可見與已發表的硬毛粗蓋孔菌存在遺傳差異，因此，結合形態分析可以確定YM11菌株為硬毛粗蓋孔菌的新菌株，編號菌株為YM11，并提交ITS序列至NCBI，獲得登錄號：OM908903。

圖4 基于ITS序列的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS sequence

2.3 YM11菌株的生物學特性

2.3.1 不同碳源對硬毛粗蓋孔菌菌絲生長的影響

在不同的碳源條件下，YM11菌株菌絲生長情況見表1。

表1 不同碳源對硬毛粗蓋孔菌YM11菌絲生長的影響Tab.1 Effect of different carbon sources on mycelial growth of Coriolopsis trogii strain YM11

如表1所示，YM11菌株的菌絲呈現出不同的生長趨勢，以葡萄糖為碳源的菌絲生長速率最快且菌絲濃密，其次為蔗糖和土豆粉，而以麩皮和乳糖為碳源時菌絲生長速率最慢且菌絲稀疏。因此，葡萄糖為YM11菌株的良好碳源。

2.3.2 不同氮源對硬毛粗蓋孔菌菌絲生長的影響

不同氮源條件下，YM11菌株菌絲生長情況見表2。

如表2所示，YM11菌株的菌絲呈現出不同的生長趨勢，以酵母粉為氮源時，表現出最快的菌絲生長速率，其次為蛋白胨和牛肉膏，且以這3種原料為碳源時菌絲濃密；而以尿素和草酸銨為氮源時，菌絲生長慢，菌絲稀疏。因此，酵母粉為YM11菌株的良好氮源。

表2 不同氮源對硬毛粗蓋孔菌YM11菌絲生長的影響Tab.2 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth of Coriolopsis trogii YM11

2.3.3 不同溫度對硬毛粗蓋孔菌菌絲生長的影響

不同溫度條件下，YM11菌株菌絲生長情況見表3。

如表3所示，YM11菌株的菌絲呈現出不同的生長趨勢，5℃～40℃時，其菌絲的生長速率和長勢均表現出先增加后減少的趨勢，其中25℃菌絲生長速率最快，其次為20℃，在這2種溫度條件下菌絲長勢也最優；而在40℃條件下菌絲不生長。因此，YM11菌株最適生長溫度為25℃。

表3 不同溫度對硬毛粗蓋孔菌YM11菌絲生長的影響Tab.3 Effect of different temperatures on mycelial growth of Coriolopsis trogii YM11

2.3.4 不同pH對硬毛粗蓋孔菌菌絲生長的影響

不同初始pH條件下，YM11菌株菌絲生長情況見表4。

如表4所示，YM11菌株的菌絲呈現出不同的生長趨勢，當pH為5.0～7.5時，其菌絲的生長速率和長勢均表現出先增加后減少的趨勢。其中pH 6.5時菌絲生長速率和長勢最優，其次為pH 6.0。因此，YM11菌株最適初始pH為6.5。

表4 不同pH對硬毛粗蓋孔菌YM11菌絲生長的影響Tab.4 Effect of different pH on mycelial growth of Coriolopsis trogii strain YM11

2.4 馴化栽培結果

硬毛粗蓋孔菌YM11菌株在3種不同配方的栽培料中均能長出菌絲。其中A配方的菌絲長滿菌袋時間最快，為接種后31 d，其次是B配方（34 d），C配方的菌絲生長最慢，長滿袋需要39 d。A、B配方的子實體產量無顯著差異，每袋1.2 kg，生物學效率達58%，C配方子實體產量為每袋0.9 kg，生物學效率為52%。

栽培子實體生長情況見圖5。

如圖5所示，硬毛粗蓋孔菌菌絲為白色，子實體生長初期為白色，成熟后為黃褐色；菌蓋上表面有密集的硬毛，下表面有密集的孔狀結構，與野生子實體的形態特征一致。

圖5 硬毛粗蓋孔菌YM11菌株的子實體生長情況Fig.5 Growth situation of fruit body of Coriolopsis trogii strain YM11

2.5 YM11菌株粗多糖的抗腫瘤活性

YM11菌株粗多糖處理MCF-7、Hela和Hep-3B腫瘤細胞觀察細胞形態（100×），再經過MTT試驗檢測抑制率，試驗結果見圖6。

如圖6A所示，細胞形態固縮、細胞數目變少，細胞受到明顯的抑制。如圖6B所示，通過MTT試驗檢測發現，腫瘤細胞的抑制率會隨著粗多糖質量濃度的增加而增加，表現出明顯的量效關系；其對MCF-7、Hela和Hep-3B腫瘤細胞半數抑制濃度分別為 2.43 mg·mL-1、1.37 mg·mL-1、2.14 mg·mL-1，說明其具有廣譜高效的抗腫瘤活性。

圖6 粗多糖對腫瘤細胞增殖的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of crude polysaccharides on tumor cell proliferation

3 討論

硬毛粗蓋孔菌在分類上目前還沒有統一，有3個拉丁名，分別為 C.trogii[6]、T.trogii[7]、F.trogii[8]。其中，T.trogii屬于栓菌屬（Trametes），其形態和ITS序列與硬毛粗蓋孔菌相似性非常高，所以常被誤認為是硬毛粗蓋孔菌，現在仍有部分學者使用該拉丁名。硬毛粗蓋孔菌也曾經一直被誤認為是法國粗毛蓋孔菌（Funalia gallica），直到2009年由我國學者確認為中國新記錄種，命名為F.trogii[22]。但其在NCBI數據分類地位上又屬于革孔菌屬（Coriolopsis），因此，目前比較廣泛應用且認可度較高的拉丁學名為C.trogii[23]。

研究通過結合形態學和分子生物學對一株野生硬毛粗蓋孔菌進行了分離與鑒定，發現該菌株與硬毛粗蓋孔菌C.trogii（MG779615.1）的ITS序列最為接近，但最高相似性僅為98%，可見與已發表的硬毛粗蓋孔菌存在遺傳差異，且系統發育樹與硬毛粗蓋孔菌在一個分支，因此確定該菌株為硬毛粗蓋孔菌的新菌株，豐富了硬毛粗蓋孔菌菌種資源。

試驗發現硬毛粗蓋孔菌最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母粉，最適初始pH為6.5，最適培養溫度為25℃。試驗結果可為該菌的菌種制備和栽培提供重要參考，對硬毛粗蓋孔菌栽培袋的培養料進行了3種配方的篩選，其中A配方菌絲生長速度最快、子實體產量最高、生物學效率最好。研究首次實現了硬毛粗蓋孔菌的人工栽培，人工栽培硬毛粗蓋孔菌具有菌蓋更大、顏色更深，菌肉更厚等性狀，且沒有覆瓦狀生長，這可能與栽培過程中環境因素和管理方式有關，今后需進一步優化栽培條件以提高子實體產量。

通過提取栽培子實體粗多糖，發現該菌的子實體多糖能抑制MCF-7、Hela和Hep-3B腫瘤細胞，其半數抑制濃度分別為 2.43 mg·mL-1、1.37 mg·mL-1、2.14 mg·mL-1，具有廣譜高效的抗腫瘤活性，可為該菌的進一步開發利用提供重要參考。