一個野生毛頭鬼傘菌株的鑒定與評價*

曹雪蓮，辜運富，陳 影，劉天海，周 潔，王 迪，彭衛(wèi)紅，唐 杰

（1.四川農業(yè)大學，四川 成都 611130；2.四川省食用菌研究所，四川 成都 610066）

毛頭鬼傘[Coprinus comatus（O.F.Müll.）Pers]，又名雞腿菇，隸屬于真菌界（Fungi）擔子菌門（Basidiomycota）蘑菇綱（Agaricomycetes）蘑菇目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）鬼傘屬（Coprinus）[1]，野生種質資源分布于我國四川、云南、河北、山東、黑龍江、山西、新疆、吉林和內蒙古等省、市（自治區(qū)）[2]。毛頭鬼傘是一種食藥兼用的真菌，營養(yǎng)豐富，具有清神寧智、增進食欲、降血脂、降血糖等保健功效[3-5]，被譽為“菌中新秀”[6]。我國毛頭鬼傘的人工栽培始于80年代初期，其生物轉化率較高、生長周期短且易于栽培，近年來在我國大宗栽培的食用菌中已經占有突出地位。目前對于毛頭鬼傘的研究主要集中在資源分類、栽培技術和生理活性等方面?，F(xiàn)有的栽培品種（菌株）較少，尚不能滿足市場對優(yōu)良品種的需求，野生種質的采集和馴化可為優(yōu)良菌株的選育提供物質基礎。因此，在成都市錦江區(qū)沙河公園采集到野生子實體后，立即對野生子實體進行組織分離純化，以形態(tài)學結合ITS序列進行分析，鑒定其為毛頭鬼傘。并進行制種和栽培試驗，通過對子實體農藝性狀觀測、營養(yǎng)成分分析和氨基酸營養(yǎng)價值評價，篩選出營養(yǎng)成分豐富、營養(yǎng)價值高的毛頭鬼傘菌株，為野生毛頭鬼傘優(yōu)良種質資源的進一步利用提供有力的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

2019年5月19日在成都市錦江區(qū)沙河公園采集到野生子實體，見圖1；川毛頭鬼傘1號，由四川省食用菌研究所提供。

圖1 野生子實體Fig.1 Fruit body collected from the wild

1.1.2 主要試劑與儀器

Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒，杭州博日科技有限公司產品；通用引物ITS4/ITS5（5′-TCTCCGCTTATTGATATGC-3′/5′-GGAAGTAAAAGTC GTAACAAGG-3′），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；1.1×T3 Super PCR Mix，北京擎科生物科技有限公司提供；Biometra PCR儀，美國伯樂儀器公司；Thermo超微量分光光度計，美國賽默飛世爾科技公司。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、磷酸氫二鉀0.1%、瓊脂2%。用于子實體組織分離、菌絲體純化和提取DNA的樣品培養(yǎng)。

母種培養(yǎng)基：蛋白胨0.2%、酵母浸粉0.2%、葡萄糖2%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、磷酸氫二鉀0.1%、瓊脂2%。

原種培養(yǎng)料：棉籽殼80%、麩皮10%、玉米粉7%、石膏1%、石灰2%，含水量60%～62%。

栽培種培養(yǎng)料：菌糠40%、麥麩30%、稻草20%、麥秸8%、石灰1%、石膏1%，含水量60%～62%。

1.2 分離純化

對野生子實體進行組織分離、純化培養(yǎng)，獲得菌株編號為C42。

1.3 鑒定

1.3.1 形態(tài)學鑒定和細胞學觀察

參照《中國食用菌百科》[7]和《中國大型真菌原色圖鑒》[8]對野生子實體進行比對；光學顯微鏡對子實體孢子和菌絲體進行觀察、形態(tài)學鑒定并描述[9-10]。

1.3.2 ITS分析鑒定

菌絲DNA提取：收集菌絲體，放入-20℃冰箱過夜，液氮研磨，利用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒進行DNA基因組的提取，超微量分光光度計檢測DNA濃度，DNA溶液置入-20℃冰箱備用。

ITS-PCR 反應體系（25 μL）：ITS4/ITS5引物各1 μL，DNA 模板 1 μL，PCR Mix 22 μL。反應條件：98℃預變性 2 min；98℃變性 10 s，55℃退火 10 s，72℃延伸10 s，共35個循環(huán)；72℃延伸2 min；4℃終止反應。PCR產物雙向測序由北京擎科生物科技有限公司完成。

測序結果在GenBank進行序列Blast比對。采用Clustal X軟件進行多序列比對，MEGA 6.1軟件計算遺傳距離、Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 栽培方法

1.4.1 母種、原種和栽培種的制備

母種制備：將分離得到的純培養(yǎng)物接種到PDA試管上（20 mm×200 mm），在25℃避光恒溫培養(yǎng)，待菌絲體長滿斜面，備用。

原種制備：將制備好的母種接種到原種瓶中，25℃避光培養(yǎng)至滿瓶，備用。

栽培種制備：栽培袋為聚乙烯袋（規(guī)格200 mm×480 mm×0.028 mm），每袋干料重0.9 kg～1.0 kg，濕料重2.4 kg～2.5 kg，袋子兩端接種，共制備50袋，20℃～25℃避光培養(yǎng)至菌絲體滿袋。

1.4.2 出菇管理

栽培種滿袋后進行覆土栽培。畦面寬1 m，畦高15 cm～20 cm，畦面均勻撒一層石灰，將栽培種菌袋放在畦面，菌袋兩端劃口，覆土3 cm～5 cm，加蓋黑色遮陽網小拱棚。每天定時將小拱棚打開通風換氣，每天定時噴灑水保持畦面濕潤。畦面出現(xiàn)原基后再次覆土，待子實體長滿畦面，對第一潮菇進行觀測和采收。采收標準為子實體菌蓋緊實，菌蓋與菌柄貼合。

1.5 農藝性狀測定

子實體農藝性狀分為觀測性狀和測量性狀。觀測性狀包括菌蓋形狀、菌蓋顏色、菌蓋鱗片有無、菌柄顏色和菌柄基部是否膨大；測量性狀為菌蓋長度、菌蓋直徑、菌柄長度、菌柄直徑和菌柄基部直徑，具體測量位置見圖2。

圖2 子實體縱切面Fig.2 Vertical section of an Coprinus comatus fruit body

1.6 營養(yǎng)成分測定和氨基酸營養(yǎng)價值評價

1.6.1 營養(yǎng)成分測定

委托四川省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所測定毛頭鬼傘新鮮子實體樣品，主要測定的營養(yǎng)成分有水分、灰分、粗纖維、粗多糖、粗蛋白和氨基酸[11-16]。

1.6.2 氨基酸營養(yǎng)價值評價

利用FAO/WHO的必需氨基酸模式[17]，計算、比較分析蛋白質的營養(yǎng)價值[18]。必需氨基酸比值（RAA）的計算公式為：

式中：Ax為必需氨基酸的含量（%）；As為（FAO/WHO）模式中相應的氨基酸含量（%）。

必需氨基酸比值系數(shù)（RC）的計算公式為：

式中：RAA為必需氨基酸比值；AR為必需氨基酸RAA比值均數(shù)。

必需氨基酸比值系數(shù)分（SRC）的計算公式為：

式中：RSD為RC的相對標準差。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel進行數(shù)據(jù)處理，用SPSS進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 鑒定結果

2.1.1 顯微形態(tài)觀察

菌株C42的擔孢子、菌絲體及菌落形態(tài)特征見圖3。

圖3 形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics

如圖3所示，菌株C42的擔孢子呈橢圓形，大小為9.84 μm×6.96 μm，表面光滑，顏色呈黑色。顯微鏡下菌株C42的菌絲半透明，有鎖狀聯(lián)合。菌株C42在25℃平板培養(yǎng)10 d～14 d，菌落的氣生菌絲密度密，菌落邊緣整齊。

2.1.2 ITS序列

菌株C42的ITS序列共658個堿基，GenBank登錄號為MW850417，以珠雞斑白鬼傘（Leucocoprinus meieagris）MH861816.1為外群，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree

如圖4所示，菌株C42與Coprinus comatus（Gen－Bank登錄號：MK169229）的相似性高達100%，并結合形態(tài)學鑒定結果，鑒定其為毛頭鬼傘（Coprinus comatus）。

2.2 農藝性狀

菌株C42和菌株C20的子實體形態(tài)見圖5，觀測性狀和測量性狀統(tǒng)計結果見表1。

圖5 菌株C20（A）和菌株C42（B）的子實體Fig.5 fruit bodies of strain C20（A）and strain C42（B）

由圖5和表1可知，菌株C42與菌株C20子實體形態(tài)相似，2個菌株的菌蓋形狀、菌蓋顏色、菌蓋鱗片、菌柄顏色和菌柄基部形態(tài)無差異。測量性狀中，菌株C42的菌蓋長度、菌柄長度和菌蓋直徑均比菌株C20的測量值大，但菌柄直徑和菌柄基部直徑均比菌株C20的測量值小。

表1 子實體的農藝性狀Tab.1 Agronomic characters of fruit bodies

2.3 營養(yǎng)成分和氨基酸營養(yǎng)價值分析

2.3.1 營養(yǎng)成分分析

菌株C42和菌株C20的營養(yǎng)成分分析結果見表2。

由表2可知，菌株C42的水分含量低于菌株C20，差異不顯著；菌株C42的灰分和粗纖維含量高于菌株C20，差異不顯著；菌株C42的粗多糖和粗蛋白含量高于菌株C20，差異顯著。

表2 2個毛頭鬼傘菌株的營養(yǎng)成分Tab.2 Nutrient composition of two strains of Coprinus comatus

2.3.2 氨基酸含量分析

對2株毛頭鬼傘的氨基酸進行檢測及計算，結果見表3。

由表3可知，C42的總氨基酸含量（TAA）、總必需氨基酸含量（TIAA）和總藥用氨基酸含量（TMAA）都高于C20。

表3 2株毛頭鬼傘氨基酸Tab.3 Amino acids of two strains of Coprinus comatus

2.3.3 氨基酸營養(yǎng)價值評價

2個毛頭鬼傘菌株的必需氨基酸含量與FAO/WHO模式譜的必需氨基酸進行比較，結果見表4。

由表4可知，菌株C42的蛋氨酸+半胱氨酸和賴氨酸的質量分數(shù)高于菌株C20，但其他必需氨基酸的質量分數(shù)均低于菌株C20。2個菌株的7種必需氨基酸質量分數(shù)均高于FAO/WHO模式譜，由此說明菌株C42和菌株C20的營養(yǎng)均衡合理，具有一定的營養(yǎng)價值。

表4 2個毛頭鬼傘菌株與FAO/WHO模式譜必需氨基酸的比較Tab.4 Comparison of indispensable amino acids between two strains of Coprinus comatu and FAO/WHO pattern spectra

計算2個毛頭鬼傘菌株的RAA、RC及SRC值，結果見表5。

由表5可知，菌株C42和菌株C20中蛋氨酸+半胱氨酸、亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸的RC＜1，表明這些氨基酸在蛋白質中相對不足；蘇氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸和賴氨酸的RC＞1，表明這些氨基酸在蛋白質中相對過剩[19]。菌株C42的SRC大于菌株C20，說明菌株C42的蛋白質營養(yǎng)價值高于菌株C20。

表5 2株毛頭鬼傘的RAA、RC及SRC值Tab.5 RAA,RC and SRC of two trains of Coprinus comatu

3 討論

由于毛頭鬼傘的營養(yǎng)價值和藥用價值較高，早在20世紀90年代就開始在全國各地大面積栽培；2020年末其產量占全國食用菌產量的0.31%，且呈現(xiàn)繼續(xù)增長趨勢；因此亟需選育優(yōu)良菌株。

通過對野生子實體進行分離純化，將獲得的毛頭鬼傘菌株C42進行覆土栽培，馴化出菇。試驗發(fā)現(xiàn)，野生子實體馴化后的菌株C42菌蓋鱗片不明顯，菌柄基部膨大，與對照菌株C20的農藝性狀相比觀測性狀無明顯差異；測量性狀中菌株C42的菌蓋長度、菌柄長度和菌蓋直徑比菌株C20的測量值高，菌柄直徑和菌柄基部直徑比菌株C20的測量值低，綜合農藝性狀較好。子實體鮮樣的營養(yǎng)成分測定結果表明，菌株C42的營養(yǎng)成分比菌株C20高，粗多糖和粗蛋白的含量有顯著差異；2個菌株的必需氨基酸質量分數(shù)均高于FAO/WHO模式譜，且第一限制氨基酸均為蛋氨酸和半胱氨酸，與曹晉良[20]研究的結果一致；比較2個菌株的SRC值，發(fā)現(xiàn)菌株C42的蛋白質營養(yǎng)價值高于菌株C20。該野生毛頭鬼傘菌株營養(yǎng)成分豐富，營養(yǎng)價值高，具有進一步發(fā)掘利用的價值。