基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接探討淫羊藿抗腫瘤作用機制

楊家軍，原明月，牛野，陳楊春華，張會宗，袁子民*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847)

腫瘤是一種嚴重危害人類健康的疾病。每年癌癥患者數(shù)量日益增加，預計到2040年，全球新增癌癥病例將達到2 840萬例。癌癥在我國發(fā)病率高，全球約有一半的胃癌、肝癌和食道癌病例來自中國[1]。癌癥早期可通過手術(shù)切除、移植、局部消融等方法治療[2]。腫瘤的發(fā)病機制和信號轉(zhuǎn)導途徑比較復雜，目前利用單一的治療方式很難取得良好的效果，現(xiàn)代研究表明靶向藥物可調(diào)控多種信號通路，為腫瘤的治療提供了新范式[3]。有研究表明多種中藥對癌細胞的生長、增殖均有抑制作用[4]。淫羊藿中主要有效成分淫羊藿苷、淫羊藿素具有抗腫瘤作用[5-6]。但目前對淫羊藿抗腫瘤作用機制研究較少，其抗腫瘤作用靶點及機制尚未完全明確。本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接的方法，探討淫羊藿抗腫瘤的潛在作用機制，為其后續(xù)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 淫羊藿活性成分的篩選及其靶點的收集 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索“淫羊藿”，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18對其成分進行篩選，并獲得其相關(guān)靶點，再通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將其轉(zhuǎn)換為標準基因名。

1.2 疾病靶點的收集 利用Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)以關(guān)鍵詞“tumor”進行檢索，合并去重后，獲取腫瘤疾病相關(guān)靶點，其中Genecards數(shù)據(jù)庫獲得的疾病靶點以Relevance score≥1作為篩選條件。

1.3 淫羊藿活性成分與疾病共同靶點的篩選 通過在線韋恩圖分析工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，將淫羊藿活性成分靶點與疾病靶點導入，繪制韋恩圖，獲得其共同靶點，將其作為淫羊藿抗腫瘤的潛在靶點。

1.4 淫羊藿活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖的構(gòu)建 利用Cytoscape 3.8.2軟件，構(gòu)建“淫羊藿活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，對其進行可視化處理。

1.5 蛋白與蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點的篩選 將活性成分與疾病共同靶點導入STRING V11.5數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)，設(shè)置物種為Homo sapiens，其他參數(shù)保持默認，獲得其PPI網(wǎng)絡(luò)信息，將其導入Cytoscape 3.8.2軟件，使用CytoNCA插件對其進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，以度值(degree)、中介中心性(betweenness)和接近中心性(closeness)作為參考值，篩選出疾病的核心靶點。

1.6 GO功能與KEGG通路富集分析 利用R x64 4.0.5軟件，借助腳本文件，將藥物與疾病共同靶點的基因名轉(zhuǎn)化為Entrez ID，將DOSE、clusterProfiler和enrichplot軟件包導入R x64 4.0.5軟件，通過運行腳本文件，對淫羊藿抗腫瘤靶點進行GO功能與KEGG富集分析，設(shè)定閾值P<0.05，篩選出具有顯著性差異的生物學過程和通路。

1.7 活性成分-核心靶點分子對接 將篩選的淫羊藿的化合物成分與關(guān)鍵靶點進行半柔性分子對接和構(gòu)象打分。在PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和PDB數(shù)據(jù)庫(https://www1.rcsb.org/)中分別下載淫羊藿活性成分的2D結(jié)構(gòu)的sdf文件和度值較高的核心靶點蛋白的PDB格式文件，利用ChemBio3D Ultra 14.0軟件將活性成分的sdf文件轉(zhuǎn)化為mol2格式文件。將靶點蛋白及活性成分導入SYBYL 2.0軟件，對靶點蛋白提取配體小分子、去除水分子、加氫等，然后進行分子對接，利用打分函數(shù)進行評價。取高分的結(jié)合構(gòu)象繪制分子對接示意圖。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿活性成分的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，檢索到淫羊藿活性成分130個，其中符合口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18的活性成分23個(見表1)。

表1 淫羊藿活性成分篩選

2.2 淫羊藿活性成分靶點與疾病靶點收集 篩選得到淫羊藿23個活性成分的相關(guān)靶點193個，腫瘤疾病相關(guān)靶點8 169個。活性成分與疾病相關(guān)靶點的交集靶點173個。韋恩圖見圖1。

圖1 淫羊藿與疾病靶點韋恩圖

2.3 淫羊藿活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖的構(gòu)建 該網(wǎng)絡(luò)共有196個節(jié)點(23個潛在活性成分和173個靶基因)，413條連線(見圖2)。潛在活性成分與疾病靶點有連線說明兩者之間存在靶向關(guān)系，表明淫羊藿中23個潛在活性成分與173個疾病靶點有靶向關(guān)系。度值排名前五的潛在有效活性成分為MOL000098-槲皮素、MOL000006-木犀草素、MOL000422-山柰酚、MOL004373-脫水淫羊藿素(anhydroicaritin)、MOL004391-(8-(3-甲基-2-苯基)-2-苯基色原酮)，其degree值分別為127、52、49、30、25。度值越大表明該成分可能在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

圖2 淫羊藿活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.4 淫羊藿抗腫瘤潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系見圖3，蛋白與蛋白相互作用中共涉及172個節(jié)點和2 901條邊，平均度值(degree)為33.7。把大于度值(degree)、中介中心性(betweenness)和接近中心性(closeness)的中位值作為核心靶點的篩選條件，利用CytoNCA插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，值越大表明該節(jié)點在PPI網(wǎng)絡(luò)中越重要，可能發(fā)揮著越重要的生物學功能。做兩次篩選后獲得27個核心靶點(見圖4)，面積越大代表degree值越大。其相關(guān)拓撲參數(shù)見表2。

表2 核心靶點及拓撲參數(shù)

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖4 核心靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.5 GO功能富集分析 GO功能富集分析結(jié)果共計2 592條，包括生物學過程(BP)2 311條、細胞組成(CC)89條、分子功能(MF)192條。根據(jù)q值排序，值越小，顏色越紅，則表示富集程度越高，分別篩選出前 10 位并繪制成氣泡圖，如圖5所示。據(jù)圖可以推測出淫羊藿治療抗腫瘤的生物學過程主要涉及細胞對化學應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to chemical stress)、氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stress)以及金屬離子反應(yīng)(response to metal ion)等；細胞組成主要與膜筏(membrane raft)、膜微結(jié)構(gòu)域(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)等相關(guān)；在分子功能中，主要涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)等。

圖5 GO富集分析氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析結(jié)果顯示潛在作用靶點參與的通路有176條。根據(jù)q值排序，值越小，顏色越紅，則富集程度越高，篩選出前30位繪制氣泡圖，如圖6所示。據(jù)圖可知，淫羊藿抗腫瘤所涉及的生物學通路包括IL-17、p53、PI3K-Akt、TNF、MAPK等信號通路，淫羊藿還可能對乙型肝炎(hepatitis B)、丙型肝炎(hepatitis C)、前列腺癌(prostate cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、人巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、肺癌等具有治療作用，表明淫羊藿的有效成分在多條通路同時發(fā)揮作用。

圖6 KEGG富集分析氣泡圖

2.7 分子對接 利用SYBYL 2.0軟件進行半柔性分子對接，驗證活性成分與疾病靶點相互作用活性。將篩選所得淫羊藿23 個潛在活性成分與度值較高的TP53、AKT1、JUN、CASP3進行分子對接，其PDB ID分別為1MA3、5WBY、6Y3V、1NMS。對接結(jié)果以打分函數(shù)Total_Score≥5為閾值，結(jié)合自由能越小，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定，Total_Score值越大[7]。Total_Score≥5表示活性成分與靶點蛋白結(jié)合較好，Total_Score>7說明結(jié)合活性很強烈[8]。分子對接結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，淫羊藿中12個活性成分均能與4個關(guān)鍵靶點對接成功。24-epicampesterol、poriferast-5-en-3beta-ol和谷甾醇(sitosterol)與TP53和CASP3均有強烈的結(jié)合活性；Anhydroicaritin-3-O-alpha-L-rhamnoside和淫羊藿苷(icariin)與TP53、AKT1、JUN、CASP3均有較好結(jié)合。其中對接評分較高的為淫羊藿苷與CASP3靶點蛋白。分子對接示意圖如圖7所示。淫羊藿苷通過形成6個氫鍵結(jié)合在GLY125、LYS137、TYR197及LEU136等氨基酸殘基所形成的疏水性口袋中, 結(jié)合力強, 因此活性也較高。

圖7 淫羊藿苷與CASP3分子對接示意圖

表3 淫羊藿活性成分與核心靶點分子對接信息表

3 討論

淫羊藿中含有黃酮、多糖、生物堿類等多種成分[9]，本研究篩選得到的活性成分如槲皮素、淫羊藿苷、木樨草素等均具有抗腫瘤的作用，并通過多種機制抑制癌癥。如木樨草素和槲皮素可分別抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231和體內(nèi)外HepG2肝癌細胞的增殖并誘導其凋亡[10-11]。

本研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿抗腫瘤的潛在作用的關(guān)鍵靶點有TP53、JUN、CASP3、MMP9、MMP2、PTGS2 等。miR-1269a可通過靶向調(diào)控TP53促進肝癌細胞的遷移[12]。JUN是與肝細胞癌相關(guān)的原生基因[13]，c-Jun是一種細胞轉(zhuǎn)錄因子，可促進細胞周期的進展和細胞增殖，可通過結(jié)合腫瘤的啟動子來調(diào)節(jié)影響腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的一些基因的表達[14]，c-Jun在乙型肝炎病毒相關(guān)腫瘤發(fā)生過程中具有重要作用，可促進肝細胞增殖和不典型增生的進展[15]。李元洪等[16]利用射頻消融聯(lián)合化療治療原發(fā)性肝癌，發(fā)現(xiàn)能明顯降低AFP、MMP、GP73水平。苦參堿能不同程度上調(diào)人肝癌SMMC-7721細胞CASP3蛋白的表達，且抑制MMP2蛋白的表達[17]。Chen等[18]研究顯示抑制PTGS2可激活PINK1/PRKN介導的有絲分裂，從而加速細胞凋亡，抑制肝癌細胞的生長。

淫羊藿總黃酮有促進免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、抗衰老等作用[19]，淫羊藿苷作為其中的代表性成分，對肺癌、卵巢癌、食管癌等多種癌細胞均具有抑制作用[20-23]，可通過下調(diào)MMP2、MMP9 表達水平，從而抑制卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。淫羊藿苷可促進抑癌基因p27表達，增高p27 mRNA水平從而抑制HepG2肝癌細胞的增殖[24]，還可激活線粒體內(nèi)ROS/JNK信號通路，誘導人肝癌SMMC-7721細胞的凋亡[25]。淫羊藿素也能夠顯著下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達，從而抑制膠質(zhì)母腫瘤細胞的黏附、遷移和侵襲能力[26]。

GO功能富集分析可知淫羊藿的活性成分通過參與DNA轉(zhuǎn)錄和氧化反應(yīng)等過程發(fā)揮抗腫瘤作用。KEGG富集發(fā)現(xiàn)淫羊藿抗腫瘤涉及的生物學通路有IL-17、p53、PI3K-Akt等信號通路，可能對乙型肝炎、丙型肝炎、前列腺癌、胰腺癌、人巨細胞病毒感染等具有治療作用，表明淫羊藿的有效成分在多條通路同時發(fā)揮作用。肝細胞癌的主要病因是乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的慢性感染[27-28]。惡性腫瘤的發(fā)生與人巨細胞病毒感染有關(guān)[29]，如人巨細胞病毒感染可能通過STAT3信號通路上調(diào)內(nèi)皮細胞特異性分子的表達促進膠質(zhì)瘤的發(fā)展[30]，還可能激活HIF-1α途徑、調(diào)節(jié)下游遷移及侵襲基因表達從而促進結(jié)腸癌細胞的遷移、侵襲[31]。分子對接結(jié)果顯示淫羊藿苷與多個疾病靶點蛋白對接評分較高，表明其結(jié)合力強，活性較高。PI3K-Akt信號通路是調(diào)節(jié)機體內(nèi)細胞生存、生長、分化及凋亡的重要信號通路，可催化相關(guān)蛋白的磷酸化發(fā)揮促癌作用[32]。有研究表明阻斷PI3K-Akt信號通路可抑制miR-182過表達，降低MMP9、c-Myc、VEGF等相關(guān)蛋白的表達，從而抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移[33]。淫羊藿苷可促使 caspase-3、caspase-9蛋白表達上調(diào)，從而誘導人肝癌HepG2細胞凋亡[34]。分子對接結(jié)果也顯示，淫羊藿苷能與CASP3靶點蛋白穩(wěn)定結(jié)合，表明淫羊藿抗腫瘤作用可能與調(diào)控PI3K-Akt信號通路、CASP3蛋白有關(guān)。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法對淫羊藿有效成分潛在的抗腫瘤靶點及信號通路進行分析，探討其抗腫瘤的潛在作用機制。通過分子對接法驗證了各成分與靶點的結(jié)合。為后續(xù)研究淫羊藿抗腫瘤的作用機制提供了參考。