腫瘤相關巨噬細胞參與貝伐單抗耐藥機制的研究進展

胡亞杰，韓天，陸滔，胡慶華

(1.中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 211198；2.上海藥明康德新藥開發有限公司，上海 200131)

在腫瘤血管生成過程中，多種細胞因子參與其中，如血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)。一種抗血管生成藥物-貝伐單抗主要通過靶向VEGF-A發揮其抗腫瘤作用。臨床上貝伐單抗的適應證包括宮頸癌、轉移性乳腺癌及非小細胞肺癌等，該藥現已被用于多種惡性腫瘤的治療[1-2]。但是，在初始應答后大量患者表現出對貝伐單抗不敏感，或者表現為腫瘤耐藥，之后腫瘤呈爆發式增殖，病情快速惡化，給臨床治療帶來了巨大的困難與挑戰。因此，闡明貝伐單抗的耐藥機制，延緩、克服其耐藥可提高貝伐單抗的臨床療效，有效延長腫瘤患者的生存期。在腫瘤微環境中，巨噬細胞是一把“雙刃劍”，其主要分為兩種類型，即M1型和M2型，然而這兩種類型的巨噬細胞在腫瘤微環境中發揮著相反的作用，M1型巨噬細胞起著“守衛者”的角色，通過介導細胞毒性而殺死腫瘤細胞；與之相反，M2型巨噬細胞促進腫瘤血管生成、以及腫瘤的發生和轉移[3-4]。并且，這兩種類型及其不同亞型之間可以相互轉化，而TAM更偏向于M2型巨噬細胞。TAM廣泛存在于不同腫瘤中，參與免疫應答以及腫瘤進展中的多個過程，并與腫瘤耐藥的發生密切相關。然而，伴隨著貝伐單抗的使用，巨噬細胞向M2型的轉變促進了腫瘤的生長與轉移，以及出現了貝伐單抗的耐藥現象[5]。現就腫瘤相關巨噬細胞參與貝伐單抗耐藥機制的相關研究予以綜述。

1 腫瘤相關巨噬細胞

巨噬細胞在機體中發揮著重要作用，其被不同的細胞因子所激活進而轉化為不同類型的巨噬細胞，如被干擾素-γ激活后，轉化為M1型巨噬細胞，參與機體的免疫反應；被白細胞介素-4(IL-4)或IL-10激活后進而轉化為M2型巨噬細胞，促進腫瘤的增殖與轉移[6]。TAM的表型通常被認為更偏向于M2型，在腫瘤的增殖過程中扮演了重要的角色[7]。

在腫瘤生長和發育中，巨噬細胞的作用是復雜且多方面的。循環的單核細胞根據內部環境的條件產生成熟的巨噬細胞，當它們被招募到腫瘤微環境中，并在適當的條件下轉化為TAM[8]。雖然有限的證據證明TAM可以直接殺死腫瘤細胞并刺激T細胞的抗腫瘤活性，但是多數研究表明TAM是腫瘤微環境的主要組成部分之一，是促進腫瘤發生發展的重要驅動因素[9-10]。例如，TAM通過分泌VEGF等細胞因子進而促進腫瘤血管的生成[11]。因此，越來越多的研究將TAM與腫瘤治療聯系起來，探究其在腫瘤治療中扮演的角色及相關的作用機制。

2 貝伐單抗

貝伐單抗商品名為Avastin，是獲得FDA批準上市的抗腫瘤血管生成藥物之一。貝伐單抗是一種IgG1型抗體，其功能主要是與VEGF結合，防止激活其受體VEGFR-1和VEGFR-2，通過這種方式抑制腫瘤新生血管生成，從而達到治療腫瘤的目的[2]。目前，貝伐單抗已被廣泛應用于臨床，為惡性腫瘤的治療提供了一種有效可行的治療方案。自2004年上市以來，貝伐單抗深受臨床治療的青睞，這主要歸功于它通過抑制新生血管的生成從而起到治療腫瘤的作用，其對多種腫瘤的治療均有效果，為惡性腫瘤的臨床治療做出了巨大的貢獻。另外，貝伐單抗的給藥間隔較長也使得其深受患者的喜愛[12]。雖然貝伐單抗已經上市很久，期間也有其他抗血管生成療法的出現，但是這些優點使得貝伐單抗依舊深受醫生和患者的青睞。臨床治療發現，早期使用貝伐單抗可以顯著降低腫瘤血管密度，明顯抑制腫瘤的發生、發展與遷移，對惡性腫瘤具有較好的治療作用。但隨著貝伐單抗給藥進程的持續，許多患者出現明顯的耐藥現象。一些患者對貝伐單抗后期的不應答使得其病情反復，甚至嚴重惡化，這給臨床治療帶來了極大的困難。因此，緩解和克服貝伐單抗的耐藥問題將對腫瘤的臨床治療產生深遠影響。

3 腫瘤相關巨噬細胞在腫瘤發生、發展中的作用

3.1 腫瘤相關巨噬細胞促進腫瘤血管的生成 腫瘤血管是惡性腫瘤轉移的主要途徑，新生血管的生成需要多種細胞以及相關因子的參與[13]。研究發現，TAM通過分泌多種促血管生成因子，例如VEGF-A、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、細胞因子轉化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等，促進腫瘤血管的生成[14]。

TAM主要是通過分泌上述描述的促血管生成因子，進而調控腫瘤新生血管生成[15]。在腫瘤低氧區域，TAM是VEGF-A的主要來源，研究表明巨噬細胞分泌的VEGF-A促進血管分支形成，幫助腫瘤新血管的形成[4]。這一現象在缺氧的環境中更為加劇，缺氧條件下主要通過缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factors，HIF)進行調節，如HIF-1α能上調巨噬細胞的VEGF-A的分泌量，從而促進新血管的生成[16]。同樣的，來自腫瘤微環境中其他類型的VEGF也有助于腫瘤血管生長。基底膜的降解是腫瘤新生血管生成的重要過程，而TAM可以分泌蛋白酶從而加速這一過程，進而促進新生血管的形成，這些蛋白酶包括基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP-2)、MMP-9等[17]。此外，TAM釋放胸苷激酶磷酸化酶(TP)和尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)通過刺激ECs的遷移，增加血管的侵襲和ECM的降解，從而促進腫瘤血管生成[16]。總的來說，這些證據表明TAM通過多種途徑參與腫瘤新生血管的形成。

3.2 腫瘤相關巨噬細胞促進腫瘤侵襲與轉移 腫瘤轉移是指癌細胞從原發灶擴散到周圍和遠處的器官，TAM主要通過對腫瘤微環境的調控，從而來促進腫瘤的轉移。研究發現，在缺乏局部血管生成的情況下，乳腺癌中腫瘤細胞的內滲與血管周圍的巨噬細胞有關，這項研究支持了TAM刺激腫瘤轉移的觀點[18]。另外，在腫瘤微環境中，集落刺激因子1(colony-stimulating factor 1,CSF-1)表達會促使巨噬細胞的聚集和腫瘤轉移這一進程的加快，在小鼠模型中，CSF-1的遺傳消融可以降低結腸癌的惡性程度[19]。除此之外，CSF-1和EGF的表達促進了腫瘤細胞和巨噬細胞的遷移，而抑制兩者可以阻止這兩種細胞的轉移[20]。TAM還可以通過分泌VEGF-C促進腫瘤的遷移，研究發現VEGF-C可以間接的促進淋巴結的轉移[21]。

在腫瘤細胞遷移與侵襲過程中，細胞外基質(ECM)是一道堅實的“屏障”，而ECM的降解是腫瘤細胞轉移的關鍵。TAM通過分泌多種蛋白水解酶，進而介導ECM降解和細胞與ECM間的相互作用，加速腫瘤的侵襲與轉移[22]。另外，腫瘤相關巨噬細胞會分泌許多外泌體(exosomes)，這些外泌體被證明在腫瘤的發生發展中起著巨大的作用。在胃腸癌腫瘤微環境中的M2型巨噬細胞會分泌大量含有載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)的外泌體，而這些外泌體與ApoE被證明能夠通過激活PI3K-Akt通路并重排細胞骨架來促進腫瘤的轉移與侵襲[23]。以上這些證據均支持了TAM促進腫瘤侵襲和遷移的觀點。

3.3 腫瘤相關巨噬細胞介導腫瘤的免疫抑制 多項研究表明TAM參與腫瘤的免疫抑制，例如M2型巨噬細胞可以通過釋放TGF-β和IL-10抑制T細胞的免疫反應，使得腫瘤細胞能逃避免疫細胞的監視[24]。另外有研究表明，調節性T細胞通過產生IL-10將巨噬細胞誘導為M2型巨噬細胞，而M2型巨噬細胞具有免疫調節和腫瘤促進的作用[25]。

雖然PD-1/PD-L1阻斷可以激活T細胞，但是這一過程對TAM的作用研究較少。在為數不多的研究中發現，隨著腫瘤進程的加重，TAM中PD-1的表達逐漸增加。研究人員通過體內阻斷PD-1/PD-L1這一途徑發現巨噬細胞的吞噬增加，并且這一過程的阻斷抑制了腫瘤的生長[26]。以上證據證明了TAM參與腫瘤的免疫抑制過程。

4 貝伐單抗耐藥機制的研究

目前，許多抗腫瘤藥物的原發性或獲得性耐藥性是癌癥治療中的一個常見問題。雖然對于貝伐單抗的耐藥已有一些研究，但具有普遍性的關鍵機制并未被闡明。目前研究較多的一些機制現介紹如下。

4.1 基因、代謝與血管擬態 隨著基因組測序技術的進步，越來越多的研究將其應用在尋找潛在的分子靶標等方面。研究人員通過利用血漿DNA全基因組測序評估了使用貝伐單抗治療的患者的腫瘤基因組，以確定與耐藥性相關的新畸變，結果顯示13q12.2擴增子在貝伐單抗治療下出現且與其治療耐藥性相關[27]。這種新的耐藥機制的發現將有助于貝伐單抗在轉移性結直腸癌患者中的治療。

在卵巢癌和乳腺癌細胞中，貝伐單抗耐藥的腫瘤細胞顯示糖酵解增加，研究表明使用抗血管生成藥物后，腫瘤的代謝表型會發生改變[28]。研究發現，去除膠質瘤細胞中的氧化磷酸化途徑會導致更多的糖酵解途徑和耐缺氧表型以誘發貝伐單抗難治性腫瘤，該項研究證明糖酵解是腫瘤細胞逃避抗血管生成治療的機制之一，并且提出抗糖酵解策略是克服貝伐單抗耐藥性的有希望的方法之一[29]。

腫瘤干細胞可以促進腫瘤形成類似血管的管道結構，即血管生成擬態(vasculogenic mimicry，VM)，相關研究認為巨噬細胞也能促進這一過程。這種管道結構雖然和血管有著相似的功能，但在超微結構上有著本質的不同，研究表明VM發生于缺氧的環境中，骨髓特異性HIF-1α的特定基因缺失導致VM網絡形成減少。因此，HIF-1α可能是VM生成的關鍵性因素，并且可能與血管生成治療的耐藥性相關[30]。一項體外研究表明貝伐單抗在HCC1937乳腺癌細胞中未能抑制VM的生成[31]。同樣的，在體內實驗中，貝伐單抗在卵巢癌模型中表現出了抗腫瘤作用，但同時也加速了腫瘤的轉移，并且在接受短期治療的小鼠中出現了明顯的缺氧和VM形成[32]。這些結果共同表明，貝伐單抗的耐藥可能與VM的形成有關。

4.2 腫瘤微環境與缺氧 腫瘤微環境是腫瘤生存的必要條件，為腫瘤細胞的生長、播散提供著必要的支撐，近年來其已成為抗腫瘤研究的新“寵兒”。目前最普遍研究的一個機制是腫瘤內部的缺氧環境會影響貝伐單抗的治療效果，并與其耐藥有一定的聯系。目前普遍認為使用抗血管生成藥物治療之后，腫瘤內部的缺氧環境會被加重，主要表現為HIF-1α的量升高，而貝伐單抗與HIF-1α拮抗劑的聯用治療在裸鼠中取得了很好效果，說明腫瘤部位的缺氧環境與貝伐單抗的耐藥有一定的關系[33]。有一些研究表明，抑癌蛋白M和噬酸因子活化因子在缺氧的環境會被激活，進而促進巨噬細胞向M2型極化，通過阻斷這兩種因子可以提高貝伐單抗的治療效果[34]。因此，對TAM的抑制可能是逆轉貝伐單抗耐藥的一個有效途徑。

5 腫瘤相關巨噬細胞參與貝伐單抗耐藥機制的研究

在早期的研究中發現抗血管生成治療后腫瘤相關巨噬細胞增多，表明其可能參與了抗血管生成治療的逃逸，并且推測TAM或許是一種潛在的耐藥生物標志物或治療靶點[35]。這項研究揭示了腫瘤相關巨噬細胞與貝伐單抗耐藥性存在著一定的關聯。

進一步，研究人員發現在貝伐單抗耐藥的膠質母細胞瘤患者標本和兩個新的異種移植瘤模型中，腫瘤相關巨噬細胞增加，并且證實了貝伐單抗耐藥可能是由腫瘤邊緣巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)減少導致M2型巨噬細胞增殖擴張驅動的，從而促進了腫瘤的生長[5]。同樣的，在晚期結直腸癌患者腫瘤組織中，增加TAM浸潤可降低貝伐單抗聯合化療的療效，在接受貝伐單抗聯合化療的晚期結直腸癌患者中，腫瘤組織中TAM浸潤可作為生物標志物[10]。這些研究證明了TAM參與了貝伐單抗的耐藥，但是具體的機制尚不清楚。

最新的一項研究認為TNF-α是M2b型巨噬細胞分泌的關鍵促腫瘤效應分子，該研究證明了腫瘤相關巨噬細胞通過分泌TNFα和激活IDO1(吲哚胺2,3-雙加氧化酶1，indoleamine 2,3dioxygenase 1)從而參與貝伐單抗的耐藥機制，研究人員通過抑制TNF-α從而逆轉了貝伐單抗的耐藥[36]。

6 結語

腫瘤相關巨噬細胞在貝伐單抗耐藥過程中起著關鍵性的促進作用，主要表現為TAM在腫瘤的生長與轉移的過程中提供關鍵的細胞因子，尤其是可釋放一些促進腫瘤血管生成、遷移、侵襲的因子。雖然已有相關研究證明了腫瘤相關巨噬細胞參與貝伐單抗的耐藥機制，但是確切的機制仍需進一步探究。因此，通過探討貝伐單抗耐藥過程中引起的相關細胞因子增多的機制，以及這些因子對TAM的調控作用，從而為緩解和克服貝伐單抗及其他抗體類藥物的臨床耐藥提供理論支持。