實時熒光定量技術(shù)在食品微生物檢測和研究中的應(yīng)用

王春梅

摘 要：為持續(xù)提升食品安全管理成效，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化檢測機(jī)制，強(qiáng)化潛在風(fēng)險識別與處置能力，相關(guān)部門以及檢測團(tuán)隊轉(zhuǎn)換思路，采取有效舉措，深度整合技術(shù)資源，全面理順檢測體系，實現(xiàn)對食品微生物的精準(zhǔn)檢測。本文以實時熒光定量技術(shù)作為技術(shù)前提，系統(tǒng)探討檢測技術(shù)的應(yīng)用路徑，旨在依托檢測技術(shù)快速完成食品微生物檢測任務(wù)，全面提升檢出率。

關(guān)鍵詞：食品;微生物;實時熒光定量技術(shù);生物檢測;應(yīng)用

Application of Real-Time Fluorescence Quantitative Technology in Detection and Research of Food Microorganisms

WANG Chunmei

（Guangrao County Center for Disease Control and Prevention， Dongying City， Shandong Province， Guangrao 257300， China）

Abstract： In order to continuously improve the effectiveness of food safety management， build a standardized testing mechanism and strengthen the ability to identify and deal with potential risks， relevant departments and testing teams have changed their thinking， taken effective measures， deeply integrated technical resources， comprehensively rationalized the testing system and achieved accurate detection of food microorganisms. This paper takes real-time fluorescence quantitative technology as the technical premise， and systematically dicusses the application path of detection technologies， aiming to quickly complete the task of food microbial detection and comprehensively improve the detection rate by relying on the detection technology.

Keywords： food; microorganism; real-time fluorescence quantitative technology; biological detection; application

實時熒光定量技術(shù)作為一種成熟的微生物檢測方法，在實踐應(yīng)用過程中表現(xiàn)出極強(qiáng)的精準(zhǔn)度與靈敏性，是現(xiàn)階段食品安全管理的重要舉措[1]。為更好地發(fā)揮其技術(shù)優(yōu)勢，規(guī)避實時熒光定量技術(shù)的應(yīng)用誤區(qū)，有必要從實踐角度出發(fā)，堅持需求導(dǎo)向、目標(biāo)導(dǎo)向以及結(jié)果導(dǎo)向，立足熒光定量技術(shù)原理，在總結(jié)過往技術(shù)應(yīng)用經(jīng)驗前提下，立足于食品微生物檢測要求，劃定檢測框架，厘清檢測流程，確保實時熒光定量技術(shù)應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)化與規(guī)范化，切實滿足現(xiàn)階段食品微生物檢測要求，強(qiáng)化食品安全風(fēng)險管控能力，加速形成良好的市場

秩序。

1 實時熒光定量技術(shù)概述

本文全面梳理實時熒光定量技術(shù)原理以及技術(shù)特點，實現(xiàn)技術(shù)觀念全面改變，明確技術(shù)應(yīng)用場景，掌握技術(shù)應(yīng)用重點，為實時熒光定量技術(shù)在食品微生物檢測中的科學(xué)、高效應(yīng)用提供方向性引導(dǎo)。

1.1 實時熒光定量技術(shù)原理

實時熒光定量技術(shù)主要通過擴(kuò)增反應(yīng)，對每個循環(huán)產(chǎn)物中的熒光信號進(jìn)行檢測，通過對起始模板開展定量以及定性分析，確保檢測數(shù)據(jù)的有效性與合理性[2]。實時熒光定量技術(shù)在熒光化學(xué)物質(zhì)的有效介入下，可以確保反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，加速檢測進(jìn)程，縮短檢測周期。在整個反應(yīng)產(chǎn)物積累過程中，熒光信號強(qiáng)度也出現(xiàn)持續(xù)變化，對每輪熒光強(qiáng)度信號開展強(qiáng)度監(jiān)測，可以快速獲取信號變化規(guī)律，在此基礎(chǔ)上，繪制熒光擴(kuò)增曲線圖，檢測人員可通過熒光擴(kuò)增曲線開展深入分析，可以在較短時間內(nèi)，快速完成檢驗分析任務(wù)，獲取目的基因初始量，實現(xiàn)對檢測對象的精準(zhǔn)識別。實時熒光定量技術(shù)在長期實踐過程中，技術(shù)類型逐步多元化，通過技術(shù)模塊的合理化選擇，滿足不同場景下的食品微生物檢測要求。從技術(shù)原理以及應(yīng)用效果來看，實時熒光定量技術(shù)具有技術(shù)成熟，操作環(huán)節(jié)簡單，成本投入較低以及較強(qiáng)可行性的特點。

1.2 實時熒光定量技術(shù)優(yōu)勢

實時熒光定量技術(shù)具有反應(yīng)速度快、靈敏性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，可滿足食品檢測工作的要求，有效兼顧了檢測精準(zhǔn)度與實效性要求，通過實時熒光定量技術(shù)的合理化應(yīng)用，可提升食品微生物檢測能力，推動食品安全管理的健全與完善[3]。實時熒光定量技術(shù)從本質(zhì)上來看，屬于封閉性反應(yīng)體系，反應(yīng)條件較為簡單，檢測工作推進(jìn)過程中，不需要電泳、染色等步驟，因此檢測流程得以簡化，客觀上縮短了食品微生物檢測周期，提升了檢測效率。同時實時熒光定量技術(shù)使用全新的升降溫機(jī)制，可靈敏地管控溫度，大大減少了擴(kuò)增反應(yīng)周期，將整個檢測周期控制在2 h內(nèi)。與常規(guī)熒光定量技術(shù)相比，實時熒光定量技術(shù)數(shù)據(jù)獲取難度較低，增強(qiáng)了檢測數(shù)據(jù)的可靠性與精準(zhǔn)性，為后續(xù)食品安全風(fēng)險評估提供了依據(jù)[4]。實時熒光定量技術(shù)依托光譜技術(shù)與計算機(jī)技術(shù)，實現(xiàn)了檢測靈敏度的有效提升。在實際應(yīng)用環(huán)節(jié)，實時熒光定量技術(shù)對于DNA檢測濃度可以到pg級別，最大程度地保證檢測效果，排除干擾因素影響。實時熒光定量技術(shù)在微生物檢測過程中，增加了熒光探針，這種檢測方案主要針對于靶序列，可以確保非特異性產(chǎn)物無法與探針進(jìn)行雜交，有效分離與特異性物質(zhì)分子量接近的物質(zhì)，實現(xiàn)特異性精準(zhǔn)劃分，確保食品微生物檢測任務(wù)的順利完成[5]。基于實時熒光定量技術(shù)優(yōu)勢，越來越多的檢測團(tuán)隊嘗試轉(zhuǎn)換思路，著眼檢測要求，采取必要舉措，推動實時熒光定量技術(shù)在食品微生物檢測中的科學(xué)、高效應(yīng)用，確保檢測的有效性與精準(zhǔn)性。

2 實時熒光定量技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

實時熒光定量技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用，要求檢測團(tuán)隊立足于檢測原理，以科學(xué)性、實用性原則為框架，采取系列舉措，確保實時熒光定量技術(shù)的合理化應(yīng)用，全面滿足食品微生物檢測

要求。

2.1 實時熒光定量技術(shù)在食品致病菌檢測中的應(yīng)用

實時熒光定量技術(shù)在食品致病菌檢測過程中，檢測人員需從實踐角度出發(fā)，認(rèn)真做好檢測流程理順、檢測方法優(yōu)化等系列工作，確保實時熒光定量技術(shù)優(yōu)勢的全面發(fā)揮，實現(xiàn)對致病菌的精準(zhǔn)識別[6]。考慮實際檢測要求，檢測人員需要合理優(yōu)化檢測環(huán)節(jié)，科學(xué)做好探針、染色等檢測步驟的優(yōu)化調(diào)整，以更好地提升檢測的有效性。基于實時熒光定量技術(shù)特性，為排除擴(kuò)增效率、試劑損耗等因素影響，在數(shù)據(jù)計算過程中，檢測人員可以充分利用Q值，借助擴(kuò)增指數(shù)增長情況，確立起始模板，以此為標(biāo)準(zhǔn)，便于開展檢測過程中的數(shù)據(jù)對比。以金黃色葡萄球菌檢測為例，在使用實時熒光檢測過程中，在做好樣本制備的基礎(chǔ)上，利用技術(shù)優(yōu)勢，技術(shù)人員可以采用TaqMan探針和SYBR Green染料兩種方法，快速定量檢測金黃色葡萄球菌，同時對于檢測數(shù)據(jù)，使用數(shù)據(jù)處理軟件，開展檢測數(shù)據(jù)分析，進(jìn)而獲得黃金葡萄球菌濃度。這種方法對目前已知的29株臨床和食源性金黃色葡萄球菌egc變種菌株、4株egc陰性金黃色葡萄球菌菌株和37株種族近似的相關(guān)菌株的檢測特異性都接近100%，在實踐過程中，表現(xiàn)出較強(qiáng)的實用屬性[7]。

2.2 實時熒光定量技術(shù)在食品基因檢測中的應(yīng)用

現(xiàn)階段，為了保證食品微生物檢測的精準(zhǔn)度，在實時熒光定量技術(shù)應(yīng)用環(huán)節(jié)，檢測人員可以有序開展食品基因檢測等工作，通過基因序列識別，提升檢測技術(shù)的應(yīng)用水平[8]。與傳統(tǒng)基因檢測方法相比，實時熒光定量技術(shù)實用性與可操作性較強(qiáng)，可快速完成檢測任務(wù)，有效滿足現(xiàn)階段食品基因檢測要求，對于食品生產(chǎn)、加工等系列活動開展提供了技術(shù)支撐。在轉(zhuǎn)基因成本定量分析中通常選擇轉(zhuǎn)基因生物基因組中的外源序列作為目標(biāo)序列，其中包括啟動子、終止子、目的基因等。根據(jù)檢測的外源目標(biāo)序列的不同分類，轉(zhuǎn)基因食品在應(yīng)用實時熒光定量檢測技術(shù)進(jìn)行檢測時，技術(shù)人員集中進(jìn)行通用序列檢測、結(jié)構(gòu)特異性序列檢測、基因特異性序列檢測，通過全方位檢測，判定基因序列，從而順利完成基因檢測任務(wù)，快速掌握基因信息。

3 實時熒光定量技術(shù)應(yīng)用注意事項

3.1 科學(xué)設(shè)定檢測標(biāo)準(zhǔn)

實時熒光定量技術(shù)在應(yīng)用過程中，為確保檢測成效以及檢測結(jié)果的精準(zhǔn)性，有必要從檢測技術(shù)原理出發(fā)，定向做好檢測樣本比較工作。基于實時熒光定量技術(shù)，在實際檢測環(huán)節(jié)，應(yīng)設(shè)定實時熒光定量反應(yīng)指數(shù)，預(yù)先框定熒光信號域值，當(dāng)檢測數(shù)據(jù)超過熒光信號域值時，可以將其認(rèn)定為真正的檢測信號，在此基礎(chǔ)上，開展數(shù)據(jù)監(jiān)測，科學(xué)定義樣本預(yù)值循環(huán)數(shù)，從而達(dá)到定量分析的目的。根據(jù)相關(guān)研究，設(shè)定的實時熒光信號域值與檢測對象起始拷貝的對數(shù)存在較為明顯的線性關(guān)系，起始檢測對象拷貝數(shù)量越多，域值越小，基于這種內(nèi)在邏輯聯(lián)系，在檢測過程中，可以根據(jù)已知的各類數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將其作為評估未知樣品檢測域值的重要依據(jù)，實現(xiàn)對未知成分屬性的科學(xué)評估[9]。

3.2 實現(xiàn)無誤差的科學(xué)處置

實時熒光定量技術(shù)在應(yīng)用過程中，在部分條件下會受到同源DNA、異源DNA、寡核苷酸雜交特異性、探針比例和細(xì)胞分解效率等因素的影響，造成定量檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差，甚至出現(xiàn)假陽性情況[7]。為排除干擾因素的影響，檢測人可借助有效的數(shù)據(jù)處理，通過數(shù)學(xué)模型，縮小誤差，確保檢測結(jié)果的精準(zhǔn)度。檢測人員需通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，借助相關(guān)軟件，設(shè)置異常數(shù)據(jù)報警提醒，從而消除數(shù)據(jù)誤差，提升整個檢測工作的精準(zhǔn)度。同時積極探索實時熒光定量技術(shù)樣品制備的簡單化、快捷化方式，逐步提升檢測成效，縮短樣本制備周期，推動整個檢測流程的有序開展。

3.3 全面提升數(shù)據(jù)分析能力

實時熒光定量技術(shù)應(yīng)用過程中會產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)，需要檢測人員根據(jù)實際需要開展定性與定量研究，通過數(shù)據(jù)發(fā)掘，排除干擾因素，確定食品中的微生物含量，順利完成食品檢測任務(wù)。基于提升數(shù)據(jù)分析能力的考量，檢測人員可吸收、借鑒以往經(jīng)驗，利用大數(shù)據(jù)技術(shù)、專業(yè)數(shù)據(jù)處理軟件對實時熒光定量檢測環(huán)節(jié)產(chǎn)生的擴(kuò)容數(shù)據(jù)等開展綜合分析，快速繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過檢測數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)的橫向?qū)Ρ龋瑴?zhǔn)確判定檢測結(jié)果。同時，開展數(shù)據(jù)分析能力培訓(xùn)與提升專項活動，定期組織人員開展系列學(xué)習(xí)活動，介紹實時熒光定量檢測數(shù)據(jù)分析新方法、新路徑，逐步提升檢測人員對于檢測結(jié)果的分析能力。

4 結(jié)語

食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中，為提升安全水平，化解潛在風(fēng)險，應(yīng)做好微生物檢測工作，實現(xiàn)食品安全的有效管理。實時熒光定量技術(shù)憑借自身優(yōu)勢，能夠較好地滿足食品微生物的檢測要求，實現(xiàn)食品安全的有效管理，減少公共衛(wèi)生事件的發(fā)生機(jī)率。本文著眼于實際，在明確實時熒光定量技術(shù)原理以及技術(shù)優(yōu)勢基礎(chǔ)上，梳理技術(shù)應(yīng)用新思路，摸索技術(shù)應(yīng)用新方法，實現(xiàn)實時熒光定量技術(shù)的高效化使用，構(gòu)建現(xiàn)代化食品微生物檢測技術(shù)體系。

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