溫州地區人群21個STR基因座的突變情況分析

林琳，蔣歡暢，任蘋，吳淑珍

溫州醫科大學，浙江 溫州 325035，1.司法鑒定中心；2.第一臨床醫學院（信息與工程學院）

短串聯重復序列（short tandem repeats, STR）是一種重要的遺傳標記，因其具有高度遺傳多態性和個體識別能力強、非父排除率高等特點，已廣泛應用于法醫物證DNA鑒定領域。STR基因座在遺傳過程中發生變異的概率較高，因為遺傳漂變，不同地區人群的常染色體STR基因座突變分布存在一定的差異。國內外對不同地區人群中有關STR基因座等位基因突變的情況均有相關報道[1-4]。本研究通過對溫州地區人群進行大量樣本檢測，對目前常用的AGCU EX22檢測系統中觀察到的STR基因座突變規律及其特征進行統計分析，為溫州地區人群的法醫學親權鑒定、DNA尋親數據庫建設與應用等提供基礎研究數據。

1 資料和方法

1.1 一般資料 日常檢案積累、支持親權關系的溫州地區人群案件共計9 418例，樣本類型有血斑、唾液斑、帶毛囊的毛發、組織等。其中父母子21 200個樣本均來自本實驗室，其中父母子三聯體2 364例，父子二聯體4 578例，母子二聯體2 476例。

1.2 儀器與試劑 96孔Veriti PCR擴增儀、3500遺傳分析儀（美國AB公司）；AGCU EX22、AGCU 21+1、AGCU X19和AGCU Database Y24試劑盒（無錫中德美聯生物技術有限公司）；SifaSTRTM23 plex 試劑盒（司法部司法鑒定科學技術研究院）。

1.3 DNA提取和STR多態性檢測 用聚苯乙烯二乙烯基苯樹脂（chelex）法提取所有檢材DNA，采用人類熒光標記STR復合擴增檢測試劑對檢材DNA進行復合PCR擴增，陽性對照用試劑盒提供的9947A，陰性對照用純水代替樣本DNA；用3500遺傳分析儀對擴增產物電泳分型檢測；采用GeneMapper ID-X 1.5軟件對分型結果進行基因型分析。

1.4 突變觀察 觀察樣本基因型的突變情況，主要是確定突變基因座、突變來源、突變步數以及發生突變等位基因的片段大小。

1.4.1 突變基因座的確定：①用AGCU EX22試劑盒對同一案例的相關樣本檢材進行檢測，若親代和子代之間21個STR基因座中檢出1～2個基因座不符合孟德爾遺傳定律，則用AGCU 21+1試劑盒增加檢測，同時用AGCU X19或AGCU Database Y24試劑盒作為輔助檢測；②若親代和子代間沒有出現新的不符合遺傳規律的矛盾基因座，并且累積親權指數（cumulative paternity index, CPI）大于10 000，作為輔助檢測的性染色體的X-STR或Y-STR基因座檢測數據也不出現新的矛盾基因座，則將這1～2個不符合孟德爾遺傳定律的基因座視為突變基因座。對于親代和子代均為純合子的疑似突變基因座，換用其他試劑盒（如SifaSTRTM23 plex）進行復核檢測，以排除是否是雜合子的一個等位基因丟失為假純合子，并驗證分型。

1.4.2 突變步數的確定：突變步數即親代和子代在遺傳過程中STR重復序列中重復單位的增加或減少個數，每增加或減少一個重復單位，則判為突變增加或減少一步。

1.4.3 突變來源的確定：STR等位基因突變表現為重復單位的增加或減少。將子代的突變等位基因與同一基因座中的父源和母源的兩個等位基因比較，步數相差最小的等位基因是發生突變的等位基因。若被檢父和被檢母同一基因座的等位基因和子代的突變等位基因相差的步數相同，則判為突變來源不明，即突變有可能來自父源，也有可能來自母源；若被檢父或被檢母的基因型為雜合子，同一基因座的兩個等位基因和子代的突變等位基因相差的步數相同，則同樣判為突變來源不明，即突變有可能來源于雜合子的其中一個等位基因，也有可能來源于雜合子的另外一個等位基因[5]。短、中、長等位基因的確定：按STR重復序列中重復單位的重復次數的多少，將每個基因座等位基因從小到大排列，將排列在前面25%、中間50%和后面25%的等位基因依次判斷為短片段等位基因、中片段等位基因和長片段等位基因[6-8]。

1.5 統計學處理方法 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析。計數資料用頻數或百分比表示，組間比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 收集的9 418例支持親權關系的案例中，共觀察到11 782次減數分裂，其中有314例發生了突變（共計319次突變事件）。突變案例中，173例來自父子二聯體樣本（174次突變事件）；31例來自母子二聯體樣本（31次突變事件）；110例來自父母子三聯體樣本（114次突變事件），其中89次是父系突變，24次是母系突變，還有1次突變不能確定突變來源。突變案例中有309例只有單個基因座發生突變，其他5例則存在2個基因座同時突變。2個基因座同時突變的情況見表1。第1、第2、第3、第4號案例存在父源性兩個基因座同時突變；第5號案例2個突變基因座中的D6S1043基因座為父源性突變，而FGA基因座的突變來源無法確定，可能來自父方，也可能來自母方。

表1 2個基因座同時突變的情況

2.2 21個STR基因座的突變率 21個基因座突變率范圍為0～3.48‰，平均突變率為1.35‰。D12S391基因座的突變率最高，達到3.48%；TPOX基因座的突變率最低，沒有觀察到突變；除Penta E、D21S11、D6S1043、D12S391、FGA基因座外，其余16個基因座的突變率均小于2‰。各基因座突變率差異無統計學意義（χ2=29.77，P＞0.05），見表2。

表2 21個STR基因座的突變次數和突變率情況

2.3 21個STR基因座的突變來源 263次突變事件來源于父系，55次突變事件來源于母系，還有1次突變事件不能確定來源。父源突變與母源突變的比例為4.78∶1。父源等位基因發生突變的概率總體上大于母源等位基因發生突變的概率，差異有統計學意義（t=4.55，P＜0.05），見表3。

表3 21個STR基因座的突變來源（次）

2.4 21個STR基因座的突變來源與重復單位的增減方向 來自父源的263次突變事件中，88次突變事件表現為重復單位的增加，115次突變事件表現為重復單位的減少，60次突變事件不能確定重復單位的增減方向；在來自母源的55次突變事件中，20次突變事件表現為重復單位的增加，24次突變事件表現為重復單位的減少，11次突變事件不能確定重復單位的增減方向。父源突變與母源突變出現重復單位增加、減少與不確定3種頻次的差異無統計學意義（χ2=0.28，P＞0.05），見表4。

表4 21個STR基因座的突變來源與重復單位的增減方向（次）

2.5 突變步數與重復單位的增減方向 本研究319次突變事件的突變步數范圍為一至四步，一步突變有308次（96.55%），二步突變有7次（2.19%）；三步突變有1次（0.31%），見圖1；四步突變有2次（0.63%），見圖2、圖3。有108次突變事件表現為DNA重復單位增加，有139次表現為重復單位減少，有72次不能明確重復單位增減方向。一步突變與二步及以上突變中出現的重復單位增加、減少與不確定3種頻次的差異具有統計學意義（χ2=7.22，P＜0.05），見表5。

表5 突變步數與重復單位的增減方向（次）

圖1 用AGCU EX22試劑盒檢測出的某案例D21S11基因座的三步突變

圖2 用AGCU EX22試劑盒檢測出的某案例D16S539基因座的四步突變

圖3 用AGCU EX22試劑盒檢測出的某案例D2S441基因座的四步突變

2.6 突變等位基因片段大小與重復單位增減方向 所有突變事件中7次發生在短片段等位基因，204次發生在中片段等位基因，79次發生在長片段等位基因，另外29次無法明確等位基因長度和位置，見表6。短、中、長片段等位基因突變出現的重復單位增加、減少與不確定3種頻次的差異具有統計學意義（χ2=26.81，P＜0.05）。

表6 突變等位基因片段大小與重復單位的增減方向（次）

2.7 基因座突變因素在尋親DNA數據庫自動比對中的應用 為了給溫州地區的民間尋親活動提供技術支持，本研究團隊自主研發建設了一個尋親DNA數據庫。經過一段時間使用后，將尋親DNA數據庫軟件升級，增加了對基因座突變因素的處理。升級后，對數據庫內所有DNA數據進行自動比對，發現金某某與蔡某某疑似存在生物學母女關系，而兩者僅有一個D8S1179基因座（本研究該基因座的突變率為0.93‰）存在一步突變的情況，見圖4。增加檢測其他的常染色體STR基因座（AGCU 21+1試劑盒）和X染色體STR基因座（AGCU X19試劑盒），都沒有出現違反孟德爾遺傳定律的矛盾基因座，見圖5、圖6。因此將D8S1179視為突變基因座，可以認為是親代該基因座的等位基因12在遺傳過程中發生一個重復單位的減少，為一步突變，子代表現為等位基因11，結論支持金某某為蔡某某的生物學母親。

圖4 用AGCU EX22試劑盒檢測出的金某某與蔡某某D8S1179基因座的一步突變

圖5 用AGCU 21+1試劑盒檢測金某某與蔡某某的基因型

圖6 用AGCU X19試劑盒檢測金某某與蔡某某的X-STR基因型

3 討論

3.1 突變率 本研究觀察到的溫州地區人群21個STR基因座的突變率范圍在0～3.48‰，除Penta E、D21S11、D6S1043、D12S391、FGA基因座外，其余16個基因座的突變率均小于2‰，各基因座的突變率之間的差異不具有統計學意義。21個STR基因座的平均突變率為1.29‰，低于目前常用的平均突變率2‰[9]，應結合各基因座的突變率計算親權指數，得出的值更為科學[7]。

STR基因座的突變率與等位基因中基序的堿基結構和重復次數有關[10]。重復單位數目多的基因座長度較長，多態性一般較高，其突變率也較高[1，11]。 畢潔等[12]對20 723例親子鑒定中19個STR基因座的北方漢族人群突變分析顯示，Penta E基因座的突變率最高，TPOX基因座的突變率最低；而本研究觀察到的突變率最高的是D12S391基因座，次高的是Penta E基因座，突變率最低的是TPOX基因座，說明不同地域人群的突變率情況有所不同。

李成濤等[13]研究表明，約100例父子或母子二聯體親權鑒定或50例三聯體親權鑒定就可能遇上1～2例等位基因突變。本研究團隊研發了尋親DNA數據庫軟件，用于尋親親子鑒定，后來在司法鑒定實踐中將STR基因座的突變因素考慮進去，對軟件進行升級，數據庫成功檢索到了一對母女，兩者之間存在D8S1179一個常染色體STR基因座突變。本研究尋親鑒定實踐表明，常染色體STR基因座等位基因突變現象較為常見，在法醫學親權鑒定和DNA尋親數據庫建設中應引起注意，應考慮突變因素。

3.2 突變來源 由于精子的DNA在精原細胞成為精子前要經過多次復制，復制次數越多，產生滑動錯配的機會就越多。在減數分裂過程中男性DNA復制的次數比女性要多，其次是精子染色體中堿基替換的累積比卵細胞快2倍[10]，因而男性突變的機會要比女性高[2-3，14]。本研究314例突變發生的319次突變事件中，發現263次父源性突變，55次母源性突變，1次不能確定突變來源，父源、母源突變比率為4.78∶1，突變來源的差異與吳微微等[15]研究結果相接近。本研究父源突變與母源突變中出現重復單位增加和減少的情況差異無統計學意義。

3.3 基因突變 基因突變是生物體子代與親代之間遺傳基因發生改變的現象。本研究主要觀察溫州地區人群的21個STR基因座的基因突變現象，了解一定地域內一群能互相交配的個體的親權鑒定常用STR基因座的突變率，便于與其他地區人群的基因突變現象進行比較。金璐璐等[16]、吳淑珍等[17]報道的溫州地區漢族人群的常染色體STR基因座遺傳多態性，是用數理統計的研究方法將獲得的數據經過數學處理，得到這些STR基因座的等位基因分布頻率、雜合度、匹配概率、個體識別力、多態信息含量、非父排除率、親子關系指數等。本研究則從基因突變的角度研究STR基因座的突變率，豐富了溫州地區人群的群體遺傳學數據。