人參皂苷Re對東莨菪堿致小鼠神經炎癥和認知功能障礙的保護作用研究

劉昌福 鄧鋼 歐陽敏 吳劍華

摘要：目的 探究人參皂苷Re對東莨菪堿誘發的C57BL/6J小鼠學習記憶障礙的改善作用及其作用機制。方法 36只雄性C57BL/6J小鼠經訓練合格隨機分為6組，即正常組、模型組、陽性組，以及人參皂苷Re低、中、高劑量組。正常組注射等體積生理鹽水，其他組腹腔注射2 mg/kg東莨菪堿溶液。同時，陽性組給予10 mg/kg多奈哌齊溶液，人參皂苷Re低、中、高劑量組分別給予10.02 mg/kg、20.1 mg/kg、40.2 mg/kg人參皂苷Re溶液，其他組灌胃等體積生理鹽水。Morris水迷宮實驗評價小鼠的記憶能力。取腦組織，HE染色和試劑盒方法測定腦組織中AChE、ChAT、TNF-α、MDA、GSH、IL-6水平。結果 與正常組相比，模型組小鼠上臺潛伏期顯著增加，TNF-α、MDA、IL-6水平顯著升高，AChE、ChAT、GSH含量和海馬神經細胞明顯減少;相比模型組，5 mg/kg多奈哌齊和10.02 mg/kg、20.1 mg/kg、40.2 mg/kg人參皂苷Re給藥后上臺潛伏期顯著降低，腦內AChE、ChAT、GSH顯著升高，而TNF-α、MDA、IL-6水平顯著降低，改善神經細胞損傷。結論 人參皂苷Re可以通過下調大腦內的炎癥反應、氧化應激及修復海馬的損傷來改善C57BL/6J小鼠的學習記憶障礙。

關鍵詞：人參皂苷Re;記憶障礙;炎癥

阿爾茨海默病（AD）是老年人中常見的進行性癡呆癥之一，影響患者記憶、思維、語言，對患者的生活質量產生不利影響[1]。研究發現，AD的可能病因包括膽堿能和β-淀粉樣蛋白（Aβ）水平、腦血流量、神經遞質波動、神經炎癥和氧化應激的發展[2]。在AD中，海馬和新皮質等大腦區域處理記憶、行為、學習和情緒反應，患者的膽堿能功能受損，乙酰膽堿（ACh）水平降低。乙酰膽堿酯酶（AChE）負責乙酰膽堿的水解[3]。因此，抑制乙酰膽堿酯酶是治療AD的關鍵[4]。氧化應激和炎癥反應在AD的發病機制中起著關鍵作用，其特征是自由基生成速率與身體抗氧化防御系統之間的不平衡[5]。有研究表明，人參皂苷Re作為人參中微量的有效成分，有助于預防健康問題，緩解腦缺血損傷[6]，提高大鼠大腦中抗凋亡介質的水平[7]，以及改善老年癡呆的線粒體病理[8]。

因此，本研究將依據東莨菪堿造模的常規途徑，研究人參皂苷Re對C57BL/6J小鼠記憶障礙的氧化還原、炎癥應激等作用，為人參皂苷Re整體入藥改善學習記憶作用的科學機制提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

取適量人參皂苷Re（大連美侖生物公司，貨號：MB6952）溶于生理鹽水中，超聲至澄清，配置成4 mg/mL人參皂苷Re溶液備用。取50片多奈哌齊片（大連美侖生物有限公司，批號：20213102E3217，規格：5 mg /片，）研磨后溶于50 mL生理鹽水中，攪拌至澄清，配置成10 mg/mL溶液備用。精密稱量60.07 mg東莨菪堿，加入300 mL生理鹽水中，超聲至澄清，即得0.2 mg/mL的東莨菪堿溶液，以上溶液均4 ℃保存。

1.2 動物分組與給藥

雄性C57BL/6J小鼠，重量36～41 g（湖南斯萊克動物公司提供），所有程序均符合《動物實驗規程》，合格證號：SCXK（贛）2022-0015。環境溫度控制在25±2 ℃，適應性飼養7天之后開始實驗。

分組實驗前，對C57BL/6J雄性小鼠進行3天的Morris水迷宮（上海移數有限公司，MWM-M）游泳訓練，剔除平臺潛伏期大于1 min的小鼠。將合格的36只小鼠隨機分為6組，每組6只，分別為正常組、模型組、陽性對照組（多奈哌齊，10 mg/kg）、人參皂苷Re低（10.02 mg/kg）、人參皂苷Re中（20.1 mg/kg）、人參皂苷Re高（40.2 mg/kg）劑量組。其中，正常組和模型組給予0.9%生理鹽水，灌胃體積為0.4 ml/20 g小鼠體重。每天上午9點稱重后，模型對照組與給藥組均腹腔注射東莨菪堿注射液，空白組腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，共給藥兩周。每天下午3點，正常組灌胃等體積0.9%生理鹽水，其他組灌胃給藥30 min后，灌胃2 mg/kg東莨菪堿溶液。

1.3 試劑

AChE、ChAT、TNF-α、MDA、GSH、IL-6檢測試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。

1.4 儀器

Morris水迷宮（上海移數有限公司，MWM -M）;MGO全波長酶標儀（賽默飛中國分公司）。

1.5 方法

1.5.1 行為學測定

在試驗開始前的兩天內，允許所有動物每天在沒有平臺的泳池中游泳60 s，以評估它們的運動活動和對周圍環境條件的適應能力。隨后5 d，放置平臺后小鼠被允許在迷宮中探索60 s，如果小鼠無法自己找到平臺，小鼠會被輕輕地引導到平臺上。無論是否找到平臺，都將其在平臺上停留15 s，每天進行兩次試驗。最后1 d，在同一個象限中放置小鼠，測量小鼠上臺時間。

1.5.2 大腦生化指標測定

行為學實驗結束后，二氧化碳安樂死。每組半數迅速取出小鼠腦海馬組織，稱重后，置于液氮中保存。勻漿后用試劑盒法測定海馬組織腦內乙酰膽堿酯酶（AChE）、乙酰膽堿轉移酶（ChAT）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、白介素-6（IL-6）、谷胱甘肽（GSH）。

1.5.3 病理染色

每組剩余小鼠取腦組織用水合氯醛處理、脫水、透明和封固等步驟后，切片（20-30μm厚），做HE染色，并在尼康倒置顯微鏡下觀察并拍攝染色圖片，通過Image-Pro Plus 5.0對切片中神經元椎體細胞進行計數。

1.6 統計分析

數據處理采用SPSS16.0統計學軟件，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數資料用比率表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1 人參皂苷Re對東莨菪堿致癡呆小鼠行為學指標的影響

模型組小鼠上臺時間（45.28±4.49） s明顯高于對照組（23.56±5.71） s，P<0.01。多奈哌齊組、人參皂苷Re低、中、高劑量組小鼠上臺時間（41.28±6.82） s、（34.67±5.12） s、（29.86±3.63） s、

（26.32±6.67）s，明顯低于模型組，P<0.01。

2.2 人參皂苷Re對小鼠腦中相關生化因子的影響

模型組小鼠腦內海馬的MDA、IL-6、TNF-α含量（187.45±10.37）ng/ml、（168.13±9.16）ng/ml、

（123.51±8.19） ng/ml，高于對照組（130.37±12.86） ng/ml、（118.62±7.39）ng/ml、（98.79±10.63）ng/ml，P<0.01;而AChE、ChAT、GSH（187.45±10.37） ng/ml、（167.13±9.16）ng/ml、（183.51±8.19）ng/ml，

低于對照組（236.47±15.88）ng/ml、（221.50±23.18） ng/ml、（237.85±16.73）ng/ml，P<0.01。另外，多奈哌齊組、人參皂苷Re低、中、高劑量組腦中MDA含量分別為（141.30±9.52） ng/ml、（160.48±9.37） ng/ml、（153.45±11.56）ng/ml、（149.20±13.75） ng/ml，IL-6含量分別為（123.11±12.80）ng/ml、（145.72±10.74）ng/ml、（139.72±9.42）ng/ml、

（134±14.83）ng/ml，TNF-α含量分別為（102.49± 8.53）ng/ml、（110.36±10.68）ng/ml、（108.45±7.68）ng/ml、（106.76±9.55）ng/ml，均低于模型組;P<0.01，且高劑量組的降低作用最為顯著。而多奈哌齊組、人參皂苷Re低、中、高劑量組腦海馬中AChE的含量分別為（229.42±14.68）ng/ml、（203.15±16.85）ng/ml、（211.92±13.78）ng/ml、（224.73±17.94）ng/ml，ChAT的含量分別為（199.11±8.75）ng/ml、（187.42±10.63）ng/ml、（191.75±11.53）ng/ml、（202.15±10.86）ng/ml，GSH的含量分別為（228.16±8.92） ng/ml、（198.14±13.76） ng/ml、（210.75±11.93）ng/ml、（231.59±16.82） ng/ml，高于模型組，P<0.01，且高劑量組的增加作用最為顯著。

2.3 人參皂苷Re對東莨菪堿致癡呆小鼠神經組織元的影響

模型組HE染色切片中神經錐體細胞數量（403±27）個明顯少于對照組（576±34）個，P<0.01。多奈哌齊組、人參皂苷Re低、中、高劑量組HE染色切片中神經錐體細胞數量（520.67±43）個、（470±25）個、（503±28）個、（545±30）個，明顯高于模型組，P<0.01。

3討論

東莨菪堿會導致野生型小鼠膽堿能下降、炎癥和氧化應激反應、腦組織病理學變化[7]，口服人參皂苷Re小鼠上臺時間明顯降低，說明人參皂苷Re能改善東莨菪堿導致的小鼠學習記憶功能障礙。大腦中AChE、ChAT、GSH水平的降低是導致AD患者認知發生障礙的原因之一，同樣MDA是氧化應激反應的脂質氧化產物，它能加劇神經元的損傷[8]?？诜藚⒃碥誖e使小鼠腦內AChE、ChAT、GSH升高，MDA降低。因此，人參皂苷Re的記憶改善作用可能與增強膽堿能、抗氧化功能有關。

東莨菪堿導致C57BL/6J小鼠大腦中皮層出現高水平的IL-6和TNF-α。IL-6和TNF-α作為神經細胞釋放的炎癥因子，會引起神經炎癥反應，引發癡呆。本研究中，給予人參皂苷Re能夠顯著抑制小鼠腦內IL-6和TNF-α水平，進而保護神經細胞。

綜上，人參皂苷Re具有改善C57BL/6J小鼠學習記憶障礙作用，該作用可能與增加AChE、ChAT含量改善膽堿能系統，增加GSH含量的抗氧化作用，及抑制MDA、IL-6，TNF-α的抗炎作用有關，為人參皂苷Re的臨床應用提供重要理論基礎。

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