核酸擴增技術在血清HIV、HBV、HCV檢測中的應用

周斌，黃小珍，藍新，曾賓，魏穎

梅州市中心血站檢驗科，廣東 梅州 514021

輸血是臨床用于治療大出血、外科手術、嚴重貧血、鐮狀細胞病等疾病的主要方法，但在臨床輸血時，所發生的輸血性傳染病是影響患者輸血健康的主要問題，由其引起的死亡率高達10.0%～15.0%[1-2]。因此，預防及控制輸血性傳染病成為研究重點。人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)是臨床常見的輸血感染性病毒，其中輸血與血制品是病毒感染的主要途徑，通過檢測血液相關病毒抗原或抗體，可降低輸血性傳染病，確?；颊呔戎伟踩訹3]。近年來，我國篩查獻血者的感染病毒時，能顯著下降血液感染，但由于病毒抗體檢測窗口長，使輸血傳染病風險增加。目前在篩查獻血血液病毒感染時，主要是采用酶聯免疫法對血液傳染病病毒進行篩查[4]。核酸擴增技術是當前血站輸血時主要檢測技術，能直接測定病毒核酸，縮短檢測耗費時間[5-6]。本研究旨在探討核酸擴增技術在血清HIV、HBV、HCV檢測中的應用效果，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年1月至2020年12月梅州市中心血站采集36 422名無償獻血者的血液樣本，在獻血前經速率法、膠體金法快速檢測后證實結果為合格，與獻血所規定的健康標準相符合[7]；所有獻血對象自主表達無傳染性疾病病史，健康狀態好；所有獻血者均留取兩管血液樣本，核酸血液樣本保存置于帶分離膠真空抗凝管，另一支血液標本用酶聯免疫法測定；血液采集前，獻血對象對本次研究知情，并簽署同意書。

1.2 儀器與試劑酶聯免疫試劑盒(北京萬泰，英科新創，法國伯樂，索林Mur)，酶聯免疫分析儀(愛康一體機)，抗-HCV、抗-HIV、HBsAg酶聯試劑。核酸檢測：全自動核酸檢測儀(北京萬泰)及配套試劑；血液HIV、HBV、HCV核酸檢測試劑(北京萬泰)。

1.3 檢測方法所有獻血者均留取兩管血液樣本，血液樣本均為5 mL，樣本留置4 h內3 000 r/min，離心20 min。酶聯免疫法：獻血者采集的血液樣本置入EDTA抗凝管內，離心15 min，3 000×g，分離血漿，全自動酶標儀檢測分析HIV、HBV、HCV陽性率。核酸檢測：采用照磁珠分離技術提取血液樣本，對傳染病毒進行全自動核酸擴增檢測，自動判讀結果。單次檢測結果陽性：核酸檢測陽性。將核酸擴增技術檢測結果與酶聯免疫法作為結果對比。若單樣本核酸反應陽性，若與酶聯免疫法檢測結果不一致，送至臨床檢驗中心鑒定病毒。所有室內質控物由衛生部臨檢中心評定，按要求進行。

1.4 觀察指標(1)比較核酸擴增技術檢測結果與酶聯免疫法的測定結果，分析HBV、HCV、HIV樣本篩查合格率；(2)分析核酸檢測結果以及陽性樣本鑒定檢測情況。

1.5 統計學方法應用SPSS20.0統計學軟件分析數據，計數資料比較采取χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 酶聯免疫與核酸擴增檢測結果比較36 422份血液樣本經酶聯免疫法和核酸擴增檢測，其HBV、HCV、HIV陽性率比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 酶聯免疫與核酸擴增檢測結果比較[例(%)]

2.2 核酸擴增樣本拆分結果36 422份血液樣本經二次重復血清免疫學檢查6樣本陰性血樣樣本匯集池數量6 071個，30個匯集池存在反應，后將其拆分單個檢測樣本，16個匯集池樣本拆分17個陽性樣本，14個匯集池樣本拆分后未檢測出非反應性，其拆分率為0.047%。17個陽性樣本經再次鑒定，HBV、HCV、HIV反應陽性樣本數分別為15個、1個、1個。

3 討論

我國對血站操作規范擬定若血液樣本測定HBV、HCV、HIV病毒感染，任有一項出現血清學指標檢測指標陽性或核酸檢測陽性，即對此類對象進行輸血的永久性屏蔽[8]。同時一直以來，輸血殘余風險是影響輸血安全性的主要問題，其存在的安全隱患是獻血者感染病毒后存在的“窗口期”[9]。為了提高輸血安全性，我國相關部門頒布了多種血站操作規范，增加血液樣本快速檢測法、核酸擴增檢測等技術，以此降低與輸血有關的傳播病原體的發生風險。但是因檢測方法以及檢測試劑的靈敏度限制，存在血液病毒檢測“窗口期”及輸血人群數量大幅度增加等，使輸血感染性疾病發生風險明顯提高[10]。

HBV、HCV、HIV病毒是血站進行輸血工作時發生的傳染性疾病的主要病毒源，當前血站篩查血液病原體時主要是采用酶聯免疫法，可有效篩查與輸血有關的傳染病原體。但是采用該種檢測技術能夠預防傳染性疾病風險，并無法阻斷輸血傳染疾病的發生過程。另外操作試劑、操作水平以及病毒“窗口期”等因素均會影響其檢測結果，導致檢測假陽性結果的出現[11]。一般HBV、抗-HCV、抗-HIV經酶聯免疫法檢測的“窗口期”在45～56 d、72 d及22 d，會增加臨床輸血傳播風險[12-13]。核酸擴增技術是當前血站輸血安全篩查的重要技術，具有較高的敏感性，其通過對血液樣本中極低微量的核酸進行檢測，能直接檢測出血液樣本病毒病原體，顯著縮短血液病毒檢測的“窗口期”，其HBV、抗-HCV、抗-HIV“窗口期”中位縮短期分別為9 d、59 d及11 d，以此在最大程度上降低穿輸血傳播疾病風險[14-15]。本研究中36 422份血液樣本經酶聯免疫法檢測HBV、HCV、HIV陽性率分別為0.33%、0.005%及0.005%；核酸擴增檢測HBV、HCV、HIV陽性率分別為0.35%、0.014%、0.011%，差異無統計學意義(P＞0.05)。結果證實采用核酸擴增技術能夠有效篩查出血液傳染性病原體，且符合率高。HANS等[16]調查印度北部獻血者病毒輸血傳播性感染，對其采用核酸擴增技術檢測，能改善中心血液安全性，阻止每年150例病毒輸血傳播性感染的發生。該技術用于輸血安全檢測過程，直接擴增病毒核酸，或相應放大病毒核酸的附帶信號，使其檢測結果轉為可視信號，以此評估血液標本內病原體病毒表達含量，為輸血者提供可靠的健康信息。

采用核酸擴增技術鑒別血液標本病毒感染體時，單陽性標本鑒別診斷的陰性率超過70%，也是影響單份血液樣本核酸檢測結果的準確性，導致核酸擴增技術檢測假陽性[17]。同時細菌、真菌污染血液樣本，或正常血漿蛋白會引起樣本非特異性擴增，導致檢測結果假陽性；此外，血液標本病毒載量高低也影響核酸檢測陽性與陰性結果[18]。本研究結果證實核酸擴增技術的檢測準確性及可行性。有研究指出，核酸擴增技術檢測靈敏度高，能直接檢測出血清樣本病原體，并能篩查出酶聯免疫檢測陰性標本內的隱匿性感染以及酶聯免疫“窗口期”[19]，但存在核酸擴增檢測漏檢原因是部分獻血人員的血液標本病毒載量較低，且低于核酸擴增檢測值下限，而病毒抗原體水平高，此時導致病原體檢測陰性率[20]。因此核酸擴增技術并不能完全替代酶聯免疫法，酶聯免疫法對血清病毒載量低、病毒抗原水平高的研究對象有較高價值，此時聯合酶聯免疫法，可提高血清低病毒載量的血清感染率，降低與輸血有關的病毒感染風險。

綜上所述，血清學病毒傳播是影響輸血安全性的主要隱患，采用核酸擴增技術可有效篩查出血清病學標志物HIV、HBV、HCV存在風險，與酶聯免疫法比較有高度符合率。因此采用核酸擴增技術用于輸血工作篩查，能降低輸血殘余風險，排除檢測假陽性樣本，了解輸血對象的健康信息，為預防與控制輸血傳播感染風險提供合理的參考信息。但對血清病毒載量低、病毒抗原水平高的血清樣本，核酸擴增技術無法完全替代酶聯免疫法與血清學檢測技術，此時血站需要選用合理的篩查技術，提高輸血安全性。