東莞地區腸桿菌科細菌碳青霉烯酶的表型與基因型分析

黃亞，謝樹金，林偲思，朱 艷，王套瑞，呂飛，程理維，方穎，黃曉君，謝佩，陳青詩，郭主聲

1.中山大學附屬東莞東華醫院檢驗科，廣東 東莞 523110；

2.廣東醫科大學基礎醫學院寄生蟲教研室，廣東 湛江 524000；

3.廣東醫科大學基礎醫學院微生物與免疫教研室，廣東 湛江 524000

碳青霉烯類抗菌藥物包括亞胺培南、美羅培南和厄他培南等，是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌所致感染最有效的抗菌藥物之一[1]。隨著該類藥物在臨床的廣泛應用，腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率呈逐年上升趨勢，產碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物耐藥最主要的機制[2]。起初所有的碳青霉烯酶都被認為是具有物種特異性和染色體編碼的β-內酰胺酶。但是，在銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌的質粒上分別發現了blaIMP-1[3]、blaOXA-23[4]和blaKPC-1[5]。最初，肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)是在肺炎克雷伯菌中發現，隨后在大腸桿菌、腸桿菌、腸沙門氏菌和非發酵菌中也有檢出KPC基因的報道[6]，有研究發現KPC基因通常位于Tn4401轉座子上[7-8]。這意味著碳青霉烯酶基因可通過質粒和轉座子等轉移元件在不同菌種間轉移，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌引起的感染形勢已經十分嚴峻。耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)主要分離自尿路、肺、腹部、手術部位和血液，免疫功能低下、機械通氣和高齡的患者容易感染CRE[9]。CRE的治療取決于感染部位，分離的病原體和耐藥性。由于治療方法的復雜性和可變性，應通過體外藥敏試驗來制定治療計劃[9]。早期發現CRE感染有助于改善治療并降低傳播感染的可能性。碳青霉烯酶抑制劑增強試驗是目前推薦度比較高的檢測方法，但是存在著耗時長(過夜培養)和只能檢測兩種碳青霉烯酶型(A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β-內酰胺酶)的缺點，快速便捷的檢測碳青霉烯酶基因是指導臨床準確用藥的關鍵，本研究使用的賽沛GeneXpert Carba-R試劑盒可在1 h內檢測5類碳青霉烯酶基因，包括blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIPM和blaOXA。本研究擬探討結合GeneXpert Carba-R和碳青霉烯酶抑制劑增強試驗快速且準確地鑒定碳青霉烯酶基因型的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株通過東莞耐藥檢測網收集2020年東莞地區的40株CRE菌株，剔除重復的樣本。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.1.2 主要儀器與試劑GeneGeneXpert儀器和Carba-R試劑盒由賽沛(上海)商貿有限公司提供，VITEK 2 Compact儀器為法國生物梅里埃公司產品，藥敏試驗紙片和培養基購自英國OXOID公司，替加環素E-test試紙條購自，緩沖液購自上海原科實業發展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的鑒定與藥敏按照《全國臨床檢驗操作規程》推薦的程序對菌種鑒定，采用VITEK 2 Compact儀器法與紙片擴散法進行藥敏試驗，嚴格按照美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)判讀藥敏，替加環素采用E-test試紙條(法國生物梅里埃公司)測定MIC值，結果判定參照美國食品與藥品監督管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)。

1.2.2 碳青霉烯酶的表型檢測采用碳青霉烯酶抑制劑增強試驗。具體方法：使用0.9%的生理鹽水將待測菌液調成0.5麥氏濁度，均勻涂布在MH瓊脂平板上，然后在瓊脂平板表面貼4張亞胺培南碳青霉烯抗菌藥物紙片。第一張紙片不添加任何液體，第二張紙片上滴加APB溶液10μL，第三張紙片上滴加EDTA溶液10μL，第四張紙片上同時滴加APB溶液10μL和EDTA溶液10μL，過夜孵育，測量紙片抑菌圈直徑，判定結果，滴加APB試劑的亞胺培南抑菌圈比亞胺培南單藥的抑菌圈擴大5 mm以上，提示產A類絲氨酸碳青霉烯酶，主要為KPC型碳青霉烯酶；滴加ETDA試劑的亞胺培南抑菌圈比亞胺培南單藥的抑菌圈擴大5 mm以上，提示產B類金屬內酰胺酶，主要為NDM型金屬酶；滴加APB試劑或ETDA試劑的亞胺培南抑菌圈比亞胺培南單藥的抑菌圈直徑沒有明顯變化，但滴加APB試劑和ETDA試劑的亞胺培南抑菌圈比亞胺培南單藥的抑菌圈直徑擴大5 mm以上，提示該菌同時產A類絲氨酸碳青霉烯酶與B類金屬內酰胺酶。

1.2.3 碳青霉烯酶的分子檢測采用GneXpert Carba-R方法檢測。具體方法：用生理鹽水稀釋將菌液至0.5麥氏濁度，吸取10μL樣品至樣本處理液中，旋渦震蕩10 s，吸取1.7 mL混合液加入到GeneXpert Carba-R試劑盒內，啟動檢測。

1.3 統計學方法采用WHONET 5.6軟件對菌株分布及藥敏結果進行統計分析。使用SPSS23.0軟件，并采用Fisher確切概率法對CRE菌株的耐藥率差異進行統計分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRE的樣本分布和構成比40株CRE菌株中肺炎克雷伯菌27株(占67.50%)，大腸埃希菌10株(占25.00%)，黏質沙雷菌1株(占2.50%)，斯氏普羅威登菌1株(占2.50%)，陰溝腸桿科細菌1株(占2.50%)。

2.2 CRE菌株的標本分布CRE菌株主要來源于呼吸道標本(16株，占40%)、尿液標本(7株，占17.5%)、血液標本(4株，占10%)、分泌物標本(4株，占10%)和其他標本(9株，占22.5%)。

2.3 CRE菌株對常用抗菌藥物的耐藥情況40株CRE菌株的常見抗菌藥物的藥敏結果顯示：亞胺培南的耐藥率為92.5%，美羅培南的耐藥率為97.5%，替加環素的耐藥率較低為40.0%，見表1。

表1 CRE菌株的藥敏結果

2.4 碳青霉烯酶表型檢測40株CRE菌株的碳青霉烯酶型檢測結果顯示：有37株(92.5%)產生碳青霉烯酶，其中產A類絲氨酸碳青霉烯酶的有24株(60%)，產B類金屬β內酰胺酶的有13株(32.5%)和未檢出碳青霉烯酶菌株3株(7.5%)。未發現同時產A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β-內酰胺酶的菌株。不同表型分布見表2。

表2 CRE菌株的表型分布情況

2.5 CRE菌株的碳青霉烯酶基因型的分布GeneXpert Carba-R測定法共檢測出攜帶碳青霉烯酶基因的有37株(占92.5%)，其中13株blaNDM(占32.5%)、24株blaKPC(60.00%)，未檢出blaVIM、blaIPM和bla-OXA基因，未發現檢出同時擁有blaNDM和blaKPC的菌株，見表3。

表3 CRE菌株的碳青霉烯酶基因型的分布

2.6 不同碳青霉烯酶基因型的CRE菌株的藥敏結果由于臨床針對不同的碳青霉烯酶型采用的治療方案不同，為了了解CRE菌株的耐藥情況，本研究檢測了攜帶blaKPC和blaNDM的CRE菌株的藥敏，結果顯示：CRE菌株對常用的抗生素的耐藥率普遍很高，其中攜帶blaKPC的CRE菌株對替加環素(54.17%)的耐藥率較低，攜帶blaNDM的CRE菌株對阿米卡星(23.07%)和替加環素(15.38%)的耐藥率較低。通過Fisher精確檢驗，攜帶blaKPC的CRE菌株對阿米卡星、替加環素和氨曲南的耐藥比攜帶blaNDM的CRE菌株的高，兩者間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，對其他抗生素的耐藥率兩者間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表4。

表4 攜帶blaKPC和blaNDM的CRE菌株的藥敏結果

3 討論

按照Ambler分子分類方法，碳青霉烯酶可分為A、B和D類。A類為絲氨酸碳青霉烯酶，以blaKPC(blaKPC-2-blaKPC-55)、blaSME(blaSM E-1-blaSME-5)、blaI-MI(blaIMI-1-blaIMI-18)、blaNMC和blaGES(blaGES-1-blaGES-43)型為主；B類為金屬β-內酰胺 酶，以blaNDM(blaNDM-1-blaNDM-29)、blaIMP(blaIMP-1-blaIMP-85)、blaVIM(blaVIM-1-blaVIM-69)、blaGIM(blaGIM-1-blaGIM-2)和blaSPM型為主；D類為OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶，以blaOXA-181和blaOXA-232為主[10]。除產生碳青霉烯酶外，少數菌株對碳青霉烯類藥物耐藥的機制是產生超廣譜β內酰胺酶和/或AmpC酶合并外膜孔蛋白表達下調或缺失[10]。

我國臨床分離的CRE菌株產生的碳青霉烯酶以KPC和NDM型為主，少數菌株產生OXA-48、IMP和VIM型碳青霉烯酶[11-13]。KPC型碳青霉烯酶最主要的亞型為KPC-2型，NDM型金屬酶中最主要的亞型為NDM-1和NDM-5型，OXA-48型碳青霉烯酶中最主要的亞型是OXA-181和OXA-232型酶[10]。

2005—2019年CHINET克雷伯菌屬細菌耐藥性監測藥敏結果顯示[14-15]，我國臨床上分離的肺炎克雷伯菌株對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率從2005年的3%上升至2019年的25%以上，增加了8倍。2018年全國細菌耐藥監測網(CARSS)數據顯示，全國1429所醫院臨床分離的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的平均耐藥率為10.1%，部分省市甚至超過20%[16]。由于不同地區不同細菌的產碳青霉烯酶型呈現出一定的差異，并且臨床針對不同碳青霉烯酶型的治療方案也不同，所以急需實驗室快速檢測并鑒定碳青霉烯酶型，指導臨床采取正確的治療方案，可以及早的選擇合適的抗生素，有效治療患者的感染。

目前，實驗室檢測碳青霉烯酶型的方法主要分為表型檢測和基因型檢測。表型檢測主要有改良碳青霉烯滅活試驗(包括mCIM和eCIM)、碳青霉烯酶抑制劑增強試驗和Carba NP試驗等，其中碳青霉烯酶抑制劑增強試驗推薦度較高[10]。基因型檢測方法主要包括基因檢測技術和酶免疫層析技術，推薦度較高的有GeneXpert Carba-R測定法和酶免疫層析技術檢測碳青霉烯酶基因[10]。受限于實驗條件和檢測成本，實驗室常用的是碳青霉烯酶抑制劑增強試驗，但是該試驗耗費時間較長，而Xpert Carba-R測定法是目前較為推薦的快速檢測方法，可以快速檢測CRE菌株攜帶的碳青霉烯酶的基因型，對指導臨床及時使用合適的抗生素有著重大意義[10]。

本研究結果顯示，東莞地區分離的CRE菌株以肺炎克雷伯菌為主，標本主要來自呼吸道標本，對多種臨床常規使用抗菌藥物耐藥，體外試驗顯示替加環素對有較好的抑菌作用。碳青霉烯酶表型檢測結果顯示以產A類絲氨酸碳青霉烯酶和產B類金屬β內酰胺酶的CRE菌株為主，GeneXpert Carba-R測定法檢測出碳青霉烯酶基因為blaNDM和blaKPC。GeneXpert Carba-R測定法共檢測出攜帶碳青霉烯酶基因的有37株(占92.5%)，其中13株blaNDM(占32.5%)、24株blaKPC(60.00%)，未檢出blaVIM、blaIPM和blaOXA基因，也未發現檢出同時擁有blaNDM和blaKPC的菌株，其結果與碳青霉烯酶表型檢測結果一致，其他未產碳青霉烯酶或者未檢出碳青霉烯酶基因的CRE菌株，可能是高產AmpC酶、超廣譜β-內酰胺酶、外膜蛋白缺失和外排泵過表達等因素導致的[17]，本次研究結果顯示如東莞地區CRE菌株是常見A類絲氨酸碳青霉烯酶或產B類金屬β內酰胺酶的CRE菌株，表型檢測和基因型檢測的結果具有一致性。

相對于碳青霉烯酶抑制劑增強試驗，GeneXpert Carba-R可以檢測出5種碳青霉烯酶基因，比碳青霉烯酶抑制劑增強試驗鑒定的碳青霉烯酶型的范圍更廣。此外，碳青霉烯酶抑制劑增強試驗需要孵育過夜和多個步驟才能獲得結果，GeneXpert Carba-R檢測只需要一個小時，這意味著GeneXpert Carba-R在鑒定碳青霉烯酶基因型和根據碳青霉烯酶基因型指導臨床依據基因型用藥方面有著更佳的優勢。本研究發現攜帶blaKPC和blaNDM的CRE菌株對阿米卡星、替加環素和氨曲南的耐藥率有明顯差別，攜帶blaNDM的CRE菌株對阿米卡星(23.07%)和替加環素(15.38%)的耐藥率較低，另外有研究顯示頭孢他啶-阿維巴坦作為一種新型的抗生素，阿維巴坦本身的結構是三乙烯二胺，因為其不具有β內酰胺的骨架結構故不易被水解，對A類、C類和部分D類酶均有較好的活性[18]，但B類的金屬酶沒有效果[19]。建議實驗室結合自身條件選擇開展碳青霉烯酶抑制劑增強試驗或GeneXpert Carba-R測定法檢測CRE菌株，對于急癥患者可通過GeneXpert Carba-R快速鑒定碳青霉烯酶的基因型，為臨床提供早期治療的參考依據，然后再通過碳青霉烯酶抑制劑增強實驗確認碳青霉烯酶型，避免單一方法出現假陰性，可以為臨床提供更快速且準確的鑒定結果，協助臨床科室針對性的啟動抗感染治療。