當歸芍藥散治療卵巢癌的網絡藥理學及分子對接分析*

趙欣杰，司富春，張漂，劉子提

河南中醫藥大學/河南省中醫方證信號傳導重點實驗室/河南省中醫方證信號傳導國際聯合實驗室，河南 鄭州 450046

卵巢癌作為嚴重威脅女性生殖健康的惡性腫瘤，因缺乏早期癥狀與體征，患者發現時已多處于中晚期，病死率高，5年生存率為20%～25%[1]。據統計，全球范圍內共有295 414例新發卵巢癌確診和184 799例死亡病例[2]，對女性健康產生了巨大威脅，對卵巢癌的治療與防控應該引起更高的重視。當歸芍藥散源于《金匱要略》，臨床用于治療盆腔炎性疾病[3]、卵巢癌[4]、卵巢囊腫[5]、痛經[6]等婦科疾患，效果顯著。結合藥理學研究結果發現：當歸對腫瘤細胞增生的抑制作用是通過抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用實現的[7]；赤芍除常見中藥功效之外，還有保肝、抗腫瘤等多種藥理作用，通過免疫系統調節、周期凋亡基因表達調控等途徑誘導腫瘤細胞死亡[8]；白術通過下調卵巢癌細胞CDK1表達阻止細胞增殖，抑制腫瘤的進一步進展[9]；茯苓、澤瀉等通過對細胞周期的調節達到抑制腫瘤進展的效果[10-11]；川芎在腫瘤的治療作用中集中表現為抑制細胞增殖和基因表達，從而誘導細胞凋亡[12]。成分多、靶點多、通路多是中藥復方治療疾病的突出特點，本文采用網絡藥理學方法研究當歸芍藥散對卵巢癌的作用機制，以期為臨床治療提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 獲取藥物活性成分和對應靶標在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索“當歸”“赤芍”“白術”“茯苓”“澤瀉”“川芎”的主要活性成分，并選定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18的活性成分[13]，查詢獲取相應候選靶標。

1.2 分析預測靶標對應基因以“人”為限定種類，對當歸芍藥散藥物候選靶標導入Uniprot數據庫(https：//www.uniprot.org/)，獲取對應基因和UNIPROTKB。

1.3 獲取卵巢癌靶標基因及藥物潛在作用靶標利用Genecards數據庫(https：//www.genecards.org/)檢索“ovarian cancer”，獲取疾病基因，并對比復方靶標，獲取重合基因作為潛在作用靶標。

1.4 構建成分-靶標網絡圖利用Cytoscape3.8.0軟件對藥物活性成分及作用靶標進行分析，繪制網絡關系圖。

1.5 核心靶標互作網絡構建限定STRING數據庫種類為“人類物種(Homo sapiens)”，獲取潛在靶標蛋白互作關系，利用繪圖軟件做出關系圖。

1.6 富集分析基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析結果從DAVID數據庫(https：//david.ncifcrf.gov/)獲取，利用Rstudio對P<0.05的前20個通路進行高級氣泡圖的繪制。

1.7 繪制成分-靶標-通路圖將所得可能與卵巢癌相關的通路、作用靶標和活性成分導入Cytoscape3.8.0軟件，繪制網絡關系圖。

1.8 預后生存分析對預測核心基因進行Kaplan-Meier Plotter數據庫在線識別，獲取預后信息，并通過Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)網站對卵巢癌和正常人基因水平進行深入鑒定。

1.9 分子對接將PPI網絡中排名靠前的有效活性成分結構保存為mol2格式，并在PDB數據庫(http：//www.rcsb.org/)下載靶蛋白數據文件，借助Autodock Tools軟件對其進行去水、加氫、計算電荷并進行分子對接分析。

2 結果

2.1 當歸芍藥散候選活性成分利用TCMSP數據庫，獲取復方中單味藥活性成分共計568個，以OB≥30%、DL≥0.18為限定條件，挑選符合條件的活性成分70個，見圖1。

圖1 當歸芍藥散活性成分

2.2 候選靶標預測活性成分對比Uniprot數據庫，獲取藥物作用靶標，并將其對比疾病基因，選取可能與卵巢癌相關作用靶標72個，見表1。

表1 當歸芍藥散潛在作用靶標信息

2.3 活性成分-靶標網絡利用Cytoscape3.8.0軟件構建成分-靶標網絡圖(圖2)。其中含節點101個(活性成分30個，作用靶標71個)，邊181條，紅色節點代表活性成分，紫色代表靶標，對應關系用灰色線條展現。由圖2可得，活性成分與靶標并非單純一一對應，而是復雜多樣的對應關系，這說明當歸芍藥散治療卵巢癌存在多靶點的特點。

圖2 當歸芍藥散成分-靶標網絡圖

2.4 核心基因互作分析利用STRING數據庫獲取核心靶標，并使用Cytoscape3.8.0軟件構建相互作用網絡圖(圖3)。其中包含77個節點和952條邊。節點越大、顏色越深，則表示連接度越高。故而腫瘤抑制因子(TP53)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、前列腺素G /H合酶2(PTGS2)、轉錄因子p65(RELA)、轉錄因子AP-1(JUN)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、孕激素受體(PGR)7個靶標可作為核心靶標。

圖3 當歸芍藥散核心靶標相互作用網絡圖

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析在DAVID數據庫獲取GO和KEGG富集結果，篩選P<0.05的通路和生物過程進行進一步分析，P值越小，說明該通路與當歸芍藥散治療卵巢癌關系越密切(圖4、圖5、圖6中，橫坐標是Gene Ratio，縱坐標是富集出來的通路，點越大表示富集基因越多，顏色越深表示P值越小，關系越密切)。GO富集分析中細胞組分(cellular component，CC)富集化比例較大體現在胞質(Cytosol)、胞核(Nucleus)等(圖4)，分子功能(molecular function，MF)主要為酶結合(Enzyme binding)(圖5)，生物過程(biological process，BP)的是藥物反應(Response to drug)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、雌二醇反應(Response to estradiol)等(圖6)。KEGG通路富集結果(圖7)顯示乙型肝炎通路、腫瘤通路等通路與當歸芍藥散治療卵巢癌的密切相關。

圖4 當歸芍藥散活性成分對應靶標的CC分析

圖5 當歸芍藥散活性成分對應靶標的MF分析

圖6 當歸芍藥散活性成分對應靶標的BP分析

圖7 當歸芍藥散活性成分對應靶標的BP分析

2.6 分析構建成分-靶標-通路關系在Cytoscape3.8.0軟件中繪制如圖8所示成分-靶標-通路網絡圖，并使用藍色三角形、紅色圓形、綠色六邊形分別代表活性成分、靶標基因和相關通路。黃芩素(baicalein)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、楊梅酮(Myricanone)、鞣花酸(ellagic acid)等是藥物作用的主要成分，靶標基因主要是TP53、VEGFA、RELA、JUN等，關聯到磷酸酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase-Akt signal transduction pathway/protein kinase B，PI3K/Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等信號通路。

圖8 成分-靶標-通路網絡圖

2.7 基因生存分析將采用Cytoscape3.8.0軟件篩選出的VEGFA、TP53、PTGS2、RELA、JUN、MMP9、PGR等7個核心基因導入到Kaplan-Meier Plotter中，結果顯示：上述7個基因的表達與卵巢癌患者的生存率呈負相關，提示卵巢癌患者預后可能與VEGFA等基因表達水平密切相關(圖9)。為明確卵巢癌與正常人基因表達水平，利用GEPIA網站分析7個與預后不良靶標基因，發現5個基因具有顯著的表達水平，見圖10。

圖9 基因表達與患者預后的生存曲線(P<0.05)

注：紅色表示腫瘤組織，灰色表示正常組織

2.8 分子對接結果選取度值靠前的黃芩素(baicalein)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、楊梅酮(Myricanone)、鞣花酸(ellagic acid)等5個活性成分與排名靠前的TP53、VEGFA、RELA、JUN進行分子對接驗證。如結合能<0，則配體和受體蛋白可以自發結合，結合能<-5.0 kcal·mol-1，表明結合活性良好[14]，見表2。結果發現，黃芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、楊梅酮、鞣花酸均與TP53有較好的結合能力，VEGFA與楊梅酮不具備自發結合能力，RELA和黃芩素、鞣花酸結合能力較好，JUN則僅與β-谷甾醇有較好結合能力。隨后，利用 PyMOL 軟件對靶點蛋白和成分對接進行可視化分析，直接展現其構象關系(以黃芩素為例)，見圖11。

圖11 黃芩素與核心標點基因的分子對接

表2 成分與靶點結合能

3 討論

“婦人腹中諸疾痛，當歸芍藥散主之[15]。”臨床對當歸芍藥散的應用很多，集中表現在婦科領域。方中藥物所含主要成分當歸多糖[16]、赤芍總苷[17]、川芎揮發油[18]、白術內酯Ⅰ[19]、茯苓多糖[20]、澤瀉醇B[21]等都可以通過不同途徑抑制腫瘤細胞生長。劉剛[22]通過文獻研究發現，當歸芍藥散加味治療卵巢癌的總體有效率達到89.76%。高升等[23]發現，當歸芍藥散可以降低腫瘤壞死因子-α的表達，抑制炎癥反應，提高生存質量。此外，復方藥物還可以通過免疫調節“下丘腦-垂體-卵巢”軸治療婦科疾病。本文通過網絡藥理學對方病進行了關聯性研究，進一步明確當歸芍藥散的作用機制，以期為臨床治療提供借鑒。

研究發現，當歸芍藥散發揮作用的主要成分是黃芩素、過氧麥角甾醇、鞣花酸。其中，黃芩素可通過激活Caspases和Bcl-2家族蛋白誘導卵巢癌HO-8910細胞凋亡[24]，過氧麥角甾醇會隨著藥物劑量的增加影響卵巢癌細胞A2780S早期凋亡率[25]，鞣花酸經實驗驗證有較廣泛的抗腫瘤作用，可通過降低體內基質金屬蛋白酶抑制腫瘤生長水平[26]。

作用靶標網絡圖結果顯示，腫瘤抑制因子、轉錄因子p65、MMP9、孕激素受體等是當歸芍藥散作用于卵巢癌的核心靶標。其中腫瘤抑制因子基因上調后可抑制卵巢癌細胞周期進程，促進癌細胞凋亡[27]，NF-κB/p65可能通過增強APR3的表達，促進卵巢癌的發生、發展[28]；MMP9通過誘導細胞形態變化，使細胞逐漸分離、擴散，從而影響卵巢癌細胞膜MUC16蛋白表達[29]；孕激素可能通過細胞周期進程，從而影響卵巢癌SKOV3、HO-8910細胞的增殖、遷移及侵襲能力[30]。預后分析結果發現，腫瘤抑制因子、MMP9、孕激素受體與預后關系十分密切，之后研究可著重分析。

經過文獻檢索和KEGG通路富集分析，當歸芍藥散治療卵巢癌主要涉及Pathways in cancer、Hepatitis B、PI3K-Akt、MAPK、VEGF等通路。焦曉路等[31]在研究中發現，PI3K-AKT信號通路與卵巢癌發生、發展以及化療耐藥程度都有明顯相關性，可以介導細胞遷移、侵襲，抑制自噬凋亡，在臨床上可根據這一表現將其作為治療靶點；MAPK信號通路受到PFKFB3對腫瘤細胞糖代謝影響，從而調控促進卵巢癌細胞的增殖遷移，可將阻斷MAPK信號通路作為卵巢癌生物治療的研究方向[32]；通過低劑量分次照射抑制VEGF表達可影響卵巢癌細胞對順鉑的敏感性[33]。

最后，本研究通過分子對接技術對排名前5位的活性成分和靶點蛋白進行分析，結果顯示黃芩素、鞣花酸與關鍵靶點蛋白結合時的結合能均小于 5.0 kcal·mol-1，提示其有良好的結合活性，說明當歸芍藥散對卵巢癌發揮作用時主要通過黃芩素、鞣花酸等對靶點來實現。

綜上，當歸芍藥散主要通過黃芩素、鞣花酸等活性成分實現對TP53、MMP9、PGR等細胞基因的表達，從而調控PI3K-Akt、MAPK、VEGF等通路，抑制卵巢癌細胞的增殖遷移過程。由此可見，當歸芍藥散治療卵巢癌具有多成分、多靶標、多通路的特點，且預后效果良好。本研究針對藥物活性成分、靶標基因進行了成方治療卵巢癌作用機制的探討，但未進行實驗驗證，下一步應從多方面展開實驗驗證，以期為臨床提供指導。