基于ciRS-7/miR-7/FAK通路研究掌葉半夏水提物對(duì)宮頸癌的抑制作用*

王明喜，張麗霞，王長(zhǎng)平，朱前勇

1.安陽市中醫(yī)院，河南 安陽 455000； 2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)每年有14萬的新增宮頸癌患者，發(fā)病率僅次于乳腺癌，這可能與我國(guó)婦女人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染率上升有一定關(guān)系[1-2]。目前，宮頸癌的主要治療方法為手術(shù)治療和放療，但不良反應(yīng)較大，且對(duì)年輕患者生育功能的保留以及對(duì)復(fù)發(fā)或晚期宮頸癌的治療造成諸多問題，因此尋找新的宮頸癌治療方法尤為重要[3-4]。

近年來，中草藥以有效、低毒的優(yōu)勢(shì)日益受到人們的重視，并作為治療腫瘤的補(bǔ)充和替代療法。掌葉半夏為植物掌葉半夏的塊莖，性辛、味平、入肝經(jīng)，具有祛風(fēng)定驚、燥濕化痰、消腫散結(jié)的功效[5-6]。現(xiàn)代研究表明，掌葉半夏水提物(pinellia extract，PE)可通過誘導(dǎo)CD+T細(xì)胞向Th1型分化，改善調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T lymphocyte,Treg)和輔助性T淋巴細(xì)胞17(T helper lymphocyte 17,Th17)的比例發(fā)揮抗腫瘤免疫作用；還可通過阻斷細(xì)胞外調(diào)解蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)的磷酸化、促進(jìn)B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白質(zhì)(B-cell lymphoma-2-associated X，Bax)的基因表達(dá)水平抑制CaSki和HeLa宮頸癌細(xì)胞株的增殖[7]。進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明，PE能改善順鉑引起的裸鼠體質(zhì)量下降及肝酶升高，同時(shí)能夠抑制CaSki裸小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)[8-9]，但對(duì)其具體機(jī)制未做深入研究。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討PE對(duì)人類宮頸癌細(xì)胞侵襲及遷移的影響，并擬建立人宮頸癌HeLa細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤模型，基于小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(circular RNA sponge for microRNA-7,ciRS-7)/microRNA-7(miR-7)/著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)信號(hào)通路探討PE改善宮頸癌的作用機(jī)制，為臨床宮頸癌的治療提供新途徑。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞人宮頸癌細(xì)胞(HeLa，中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，細(xì)胞目錄號(hào)：TChu187)；SPF級(jí)BALB/c-nu雌性裸小鼠18只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，(7±1)周齡，體質(zhì)量(20±2)g，動(dòng)物合格證號(hào)：201711179，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2017-1-003，所有小鼠均籠養(yǎng)在相同條件下，室溫控制在(24±1) ℃，自由攝食、飲水，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由安陽市中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(HNN02019-0129)。

1.2 藥物與試劑PE(上海禾午生物科技，貨號(hào)：S24752)；胎牛血清(北方智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，貨號(hào)：10099141C)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)：ML2766)；FAK抗體(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：A097939)；p-FAK山羊抗兔單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab81298)；IgG辣根過氧化酶(horseradish reroxidase,HRP)標(biāo)記二抗多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-40295G-HRP)；GAPDH單克隆抗體、TRIzol 試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)：SY0635、BTN71201)；Go ScriptTM 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(普洛麥格生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：A2800)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(上海谷研實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：GOY-0606P)；DMEM培養(yǎng)基(上海戶實(shí)醫(yī)藥科技有限公司，貨號(hào)：12800-017)；牛胎兒血清(美國(guó) Invitrogen 公司，貨號(hào)：A3161001C)；青霉素(湖北威德利化學(xué)科技有限公司，規(guī)格：5 kg/瓶，貨號(hào)：HBW-M9)；鏈霉素(湖北廣奧生物科技有限公司，規(guī)格：25 kg/桶，貨號(hào)：GA3807)；羅斯威爾公園紀(jì)念研究所(roswell park memorial institute,RPMI) 1640培養(yǎng)基(上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司，貨號(hào)：10-040-CV)；引物序列委托上海生物工程技術(shù)公司合成。

1.3 儀器DM500型光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、VORTEX 3型漩渦混勻器、DC300F型生物顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)；JY04S-3C型凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海創(chuàng)賽科技有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將HeLa細(xì)胞復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)移至DMEM培養(yǎng)基中(含10%熱滅活的牛胎兒血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)，在5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，用0.5%胰蛋白酶消化傳代，傳2至3代后備用。

2.2 Transwell小室法檢測(cè)HeLa細(xì)胞侵襲、遷移能力Transwell小室用孔徑6.5 mm微孔膜分隔為上室和下室。收集2.1項(xiàng)下所得的宮頸癌HeLa細(xì)胞，分為HeLa細(xì)胞對(duì)照組和HeLa細(xì)胞PE干預(yù)組(0.15 g·L-1)。于4 ℃、3 000 r·min-1下將兩組HeLa細(xì)胞離心10 min，棄上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌，反復(fù)進(jìn)行3次，取200 μL HeLa懸液置于Transwell上室，并加600 μL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液到Transwell下室，培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室用預(yù)冷PBS沖洗2次，輕輕擦去上室細(xì)胞，甲醇固定膜及膜上細(xì)胞15 min，結(jié)晶紫染色30 min，33%醋酸溶液洗脫，顯微鏡下觀察拍照，計(jì)算細(xì)胞計(jì)數(shù)[10]。上述操作重復(fù)3次取均值。

2.3 動(dòng)物分組、移植瘤模型制備及藥物干預(yù)將18只BALB/c-nu雌性裸小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成正常對(duì)照組、皮下移植瘤模型組和PE干預(yù)組，每組6只。取2.1項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107mL-1，除正常對(duì)照組外，其余組裸小鼠頸背部皮下注射接種人宮頸癌HeLa細(xì)胞0.2 mL建立移植瘤模型。接種13天后，瘤體直徑大約5 mm，此時(shí)PE干預(yù)組裸小鼠以10 mg·kg-1劑量腹腔注射0.2 mL PE，每天1次，連續(xù)3周，其余組給予同等體積的生理鹽水。

2.4 荷瘤小鼠腫瘤體積及抑瘤率的計(jì)算用藥3周后，分別測(cè)量移植瘤的長(zhǎng)徑、短徑，計(jì)算腫瘤體積V=長(zhǎng)徑×短徑2/2，評(píng)估3組小鼠移植瘤的大小。小鼠脫臼處死，取腫瘤并稱其質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。

抑瘤率=(對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-干預(yù)組平均瘤質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%

2.5 RT-qPCR法檢測(cè)各組小鼠腫瘤組織中ciRS-7mRNA及miR-7mRNA的表達(dá)水平取0.1 g小鼠腫瘤組織，放入研缽中，在液氮中將其充分研磨后，倒入1.5 mL EP管中，加入1 mL TRIzol溶液，振蕩混勻。室溫孵育10 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上層清液，根據(jù)1 mL TRIzol加入 200 μL 氯仿比例，加入專用氯仿，振蕩15 s，冰浴靜置20 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心20 min，取上清液，加入450 μL異丙醇，混勻，-20 ℃孵育40 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心20 min，棄去上清液，加入1 mL冰浴的75%乙醇洗滌沉淀，使沉淀懸浮，4 ℃，7 500 r·min-1離心10 min，棄去上清液。PCR擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min(共35個(gè)循環(huán))，72 ℃總延伸6 min。隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析目的基因和參比基因GAPDH的條帶灰度值[11]。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 Western Blot法檢測(cè)各組小鼠腫瘤組織中FAK蛋白的表達(dá)水平取腫瘤組織100 mg，研碎后，加入總蛋白提取液，冰浴后于4 ℃下10 000 r·min-1離心10 min，取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度至5 mg·L-1，取20 μL，水浴加熱變性后上樣，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同相對(duì)分子質(zhì)量蛋白分離，轉(zhuǎn)到PVDF膜上，將膜洗滌后在5%牛血清蛋白溶液中室溫封閉60 min，TBST洗滌后4 ℃孵育一抗(FAK、p-FAK GAPDH一抗稀釋比例為1500)，過夜后孵育HRP標(biāo)記的鼠抗兔二抗(12 000)，室溫下振蕩孵育2 h，清洗后用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，顯色后，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，Image- QuaNT軟件測(cè)光密度，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)光密度值[12]。

3 結(jié)果

3.1 PE對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell小室法檢測(cè) HeLa細(xì)胞侵襲能力的變化發(fā)現(xiàn)，與HeLa細(xì)胞對(duì)照組比較，HeLa細(xì)胞PE干預(yù)組細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著降低(P<0.01)，提示PE可抑制HeLa細(xì)胞的侵襲能力。見圖1，表2。

注：A：HeLa細(xì)胞對(duì)照組；B：HeLa細(xì)胞PE干預(yù)組

表2 PE對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響

3.2 PE對(duì)HeLa細(xì)胞遷移能力的影響Transwell小室法檢測(cè) HeLa細(xì)胞遷移能力的變化發(fā)現(xiàn)，與HeLa細(xì)胞對(duì)照組比較，HeLa細(xì)胞PE干預(yù)組細(xì)胞遷移數(shù)目顯著降低(P<0.01)，提示PE可抑制HeLa細(xì)胞的遷移能力。見圖2，表2。

注：A：HeLa細(xì)胞對(duì)照組；B：HeLa細(xì)胞PE干預(yù)組

3.3 PE對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響與皮下移植瘤模型組比較，PE干預(yù)組荷瘤裸鼠腫瘤體積明顯變小(P<0.01)，腫瘤質(zhì)量明顯降低(P<0.01)，提示PE對(duì)宮頸癌小鼠具有顯著的抑瘤作用。見圖3，表3。

表3 PE對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響

注：A：皮下移植瘤模型組小鼠；B：PE干預(yù)組小鼠；C：皮下移植瘤模型組與PE干預(yù)組小鼠腫瘤大小

3.4 PE對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織中FAK蛋白表達(dá)水平的影響與正常對(duì)照組比較，皮下移植瘤模型組小鼠FAK蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，p-FAK蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；而PE干預(yù)組FAK蛋白及p-FAK蛋白的表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)。與皮下移植瘤模型組比較，PE干預(yù)組FAK蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，p-FAK蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明，PE促進(jìn)FAK蛋白的磷酸化。見圖4。

注：A：正常對(duì)照組；B：皮下移植瘤模型組；C：PE干預(yù)組；與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與皮下移植瘤模型組比較，#P<0.05

3.5 PE對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織中ciRS-7mRNA、miR-7mRNA表達(dá)的影響與正常對(duì)照組比較，皮下移植瘤模型組ciRS-7mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-7mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；PE干預(yù)組ciRS-7mRNA、miR-7mRNA的表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)。與皮下移植瘤模型組比較，PE干預(yù)組ciRS-7mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miR-7mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 PE對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織ciRS-7 mRNA、miR-7 mRNA表達(dá)的影響

4 討論

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，宮頸癌診療水平大幅提高，但發(fā)病率仍居高不下，給女性的生命健康造成了嚴(yán)重威脅[13]。宮頸癌的臨床治療主要是以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，然而，由于藥物的毒性作用以及腫瘤細(xì)胞的耐藥性導(dǎo)致治療效果產(chǎn)生了極大限制[14-15]，因此，需要探尋新的藥物治療手段。

掌葉半夏又名虎掌南星，具有定驚祛風(fēng)、化痰散結(jié)的功效。研究表明，掌葉半夏浸出液可使HeLa宮頸癌細(xì)胞凝縮成團(tuán)塊，失去正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)；還可導(dǎo)致部分細(xì)胞脫落，對(duì)宮頸癌有明顯的抑制作用[16-17]；由掌葉半夏等中藥制成的薄膜對(duì)宮頸癌前病變同樣具有一定的阻斷作用[18]。PE可以通過抑制ERK磷酸化及B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)及病毒癌基因E6的表達(dá)，上調(diào)抑癌基因P53的表達(dá)等抑制宮頸癌細(xì)胞株Cski和HeLa的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19-20]。本研究顯示，PE的干預(yù)可顯著降低HeLa細(xì)胞侵襲及遷移數(shù)目，與上述文獻(xiàn)研究結(jié)果相符。

研究顯示，抑癌因子miR-7在人宮頸癌組織中的表達(dá)明顯低于正常宮頸組織[21]；ciRS-7具有miR-7的海綿樣吸附作用，可抑制miR-7 的功能，在人宮頸癌組織中的表達(dá)高于正常宮頸組織[22-23]。ciRS-7/miR-7軸不僅具有重要的生物學(xué)作用，同時(shí)參與機(jī)體多種疾病的發(fā)生發(fā)展。FAK是一種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白酪氨酸激酶，參與胞內(nèi)多條信號(hào)通路的傳導(dǎo)[24]。有關(guān)研究顯示，ciRS-7包含了miR-7，ciRS-7能提高miR-7靶基因表達(dá)，miR-7通過靶定FAK來抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移[25]。FAK在多種類型的腫瘤細(xì)胞中都出現(xiàn)表達(dá)量和活性上調(diào)現(xiàn)象，通過激酶依賴和非激酶依賴機(jī)制參與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、生長(zhǎng)和抗凋亡等多個(gè)過程[26-27]。YUAN等[28]通過分析人乳腺癌的病例，發(fā)現(xiàn)FAK表達(dá)隨乳腺癌惡性程度增高而增加。在本研究結(jié)果中，PE提高FAK蛋白的磷酸化，而降低FAK蛋白的表達(dá)，可能是因?yàn)镻E抑制miR-7mRNA的表達(dá)水平，增加ciRS-7mRNA的表達(dá)，從而降低了下游FAK蛋白的表達(dá)量。推測(cè)，PE可能通過調(diào)節(jié)ciRS-7/miR-7/FAK通路抑制宮頸癌荷瘤小鼠腫瘤組織的生長(zhǎng)。

綜上所述，PE可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的侵襲和遷移，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能與調(diào)控ciRS-7/miR-7/FAK信號(hào)通路有關(guān)。