金水緩纖組分方Ⅱ通過調控SETDB1/Snai1表觀抑制A549細胞上皮間質轉化*

許朋俐，劉田田

1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046； 2.呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心，河南 鄭州 450046； 3.河南省中醫藥防治呼吸病重點實驗室，河南 鄭州 450046

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是慢性纖維化性間質性肺炎的一種特殊類型[1]，中醫將其歸于“肺痹”“肺痿”的病癥范疇[2]。李建生教授將其病機概括為“正虛絡痹積損”[3]，并據多年臨床經驗擬定了金水緩纖方(ZL.201610877761.4)[4]。課題組在金水緩纖方的基礎上，通過系統藥理學結合體內外實驗驗證篩選出成分清楚、與原方療效相當的金水緩纖組分方Ⅰ(ZL.201811415482.1)，并進一步通過實驗配比優化篩選出了療效明顯、組分明確的金水緩纖組分方Ⅱ(effective-component compatibility of Jinshui Huanxian formula Ⅱ，ECC-JHF Ⅱ)，即淫羊藿苷、川陳皮素、貝母素甲、芍藥苷、異甘草素(比例為10026.256.258)[5]。

特發性肺纖維化發病機制復雜，上皮間質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是其發生發展的重要病理機制之一[6]。課題組前期動物實驗和細胞實驗研究表明，金水緩纖方及其組分方能有效改善肺纖維化，緩解上皮間質轉化[7-8]。鋅指轉錄因子1(snail family zinc finger 1,Snai1)作為EMT的“主轉錄因子”，能通過抑制E-鈣粘蛋白(E-cadherin)等上皮細胞標志蛋白的表達，激活N-鈣粘蛋白(N-cadherin)等間充質細胞標志蛋白的表達，促進EMT的發生[9]。組蛋白賴氨酸N端甲基轉移酶SET結構域分支型1(SET domain，bifurcated 1，SETDB1)，也稱為ESET或KMT1E，是一種對組蛋白H3第9位賴氨酸甲基化修飾的特異性甲基轉移酶，參與常染色質基因的轉錄沉默。在一項乳腺癌的研究中發現，SETDB1通過對組蛋白的甲基化修飾，打破組蛋白甲基化和乙酰化的平衡，抑制Snail1基因表達[10]。基于此，本研究在細胞水平探討金水緩纖組分方Ⅱ調控SETDB1及Snai1對EMT的表觀抑制作用。

1 材料

1.1 細胞人非小細胞肺癌細胞(A549，細胞目錄號：TCHu150)，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.2 藥物與試劑川陳皮素(nobiletin，NBN)、異甘草素(isoliquiritigenin，ISO)、芍藥苷(paeoniflorin，Paeo)、淫羊藿苷(icariin，ICA)和貝母素甲(verticine，PEI)(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-16070901、MUST-17012503、MUST-16041901、MUST-17051810、MUST-16031101)；轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1，美國PeproTech公司，貨號：100-21C-10)；吡非尼酮(pirfenidone，PFD，美國Sigma公司，貨號：P2116)；羅斯威爾公園紀念研究所(roswell park memorial institute,RPMI)-1640培養基、PBS緩沖液、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)-胰蛋白酶消化液、特級胎牛血清(以色列Biological Industries公司，貨號：01-100-1ACS、02-024-1ACS、03-050-1ACS、04-001-1ACS)；青霉素-鏈霉素溶液(武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：PB1801220)；Lipofectamine 3000細胞轉染試劑、BCA蛋白定量試劑盒(賽默飛世爾公司，貨號：L3000015、A53225)；聚丙烯酰胺凝膠電脈(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司，貨號：PG112)；抗GAPDH、纖維連接蛋白(fibronection,FN1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、N-cadherin抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，貨號：60004-1-IG、15613-1-AP、14395-1-AP、22018-1-AP)；抗E-cadherin抗體(美國GeneTex公司，貨號：GTX100443)；抗波形蛋白(Vimentin)抗體(英國Abcam公司，貨號：ab92547)；抗SETDB1、組蛋白H3第9位點賴氨酸三甲基化(histone He lysine 9 trimethylation,H3K9me3)抗體(美國Cell Signaling Technology公司，貨號：93212S、13969S)；抗Snai1抗體(美國Proteintech公司，貨號：19099-1-AP)；重組蛋白A(美國Millipore公司，貨號：IP05)；靶向setdb1的小干擾RNA(siRNA-setdb1，基因序列：F：5′-GAUCUAUCGAGGCUCUACA-3′；R：5′-UGUAGAGCGAUGUC-3′)委托上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.3 儀器TS100型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；3131型CO2培養箱(美國Thermo公司)；1658001型基礎電泳儀電源、1703930型小垂直板電泳槽、1645050型小型轉印槽、ChemiDoc MP型全能型成像系統(美國BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1 細胞培養用含有10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640完全培養基培養A549細胞，將其置于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養，定期在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態，每兩天進行一次換液，當細胞生長面積達到細胞培養皿底面積的90%左右時，進行細胞傳代處理，以保證細胞在對數生長期內。

2.2 藥物制備及給藥按比例稱量NBN、ISO、Paeo、ICA和PEI并溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液，配成濃度為61.25 g·L-1的母液，過濾除菌后放-20 ℃冰箱備用；用含5% BSA的PBS將TGF-β1溶解至10 mg·L-1，放-80 ℃備用；PFD用DMSO配成0.4 g·L-1的溶液，放 -80 ℃ 備用。使用時用RPMI-1640完全培養基將以上藥物稀釋至工作濃度，加至細胞培養皿中。

2.3 A549細胞活力的檢測將生長狀態較好的A549細胞接種于96孔細胞培養板中，每孔接種細胞數為1×104個，設置6個復孔。放入37 ℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養24 h，待其生長密度約為70%時，加入不同濃度(0 mg·L-1、3.83 mg·L-1、7.66 mg·L-1、15.31 mg·L-1、30.63 mg·L-1、61.25 mg·L-1、122.50 mg·L-1)的ECC-JHF Ⅱ培養48 h；每孔加10 μL CCK8溶液(注意不要產生氣泡，以防影響酶標儀讀數)，于 37 ℃ 恒溫箱孵育1 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光值。

2.4 Western Blot檢測A549細胞中EMT相關蛋白表達水平將生長狀態較好的A549細胞接種于6孔細胞培養板中，每孔接種1×105個細胞，放入37 ℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養24 h，待其生長密度約為70%時，將細胞分為空白組、TGF-β1組、ECC-JHF Ⅱ組和PFD組，空白組和TGF-β1組加入2 mL含2 μL DMSO的RPMI-1640完全培養基，ECC-JHF Ⅱ和PFD組分別加入含相應藥物的培養基，作用12 h后，除空白組外，各組加入5 μg·L-1TGF-β1誘導12 h、24 h或36 h后，用RIPA蛋白裂解液提取蛋白，在冰上裂解30 min后，12 000×g、4 ℃離心15 min。使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度后，加入5×上樣緩沖液，將其調整至相同蛋白濃度，100 ℃煮沸5 min。凝膠電泳將其分離并轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，孵育一抗(E-cadherin、N-cadherin、GAPDH稀釋比例為15 000；FN1、α-SMA稀釋比例為 12 000；Vimentin稀釋比例為12 500；Snai1稀釋比例為1500；SETDB1、H3K9me3稀釋比例為11 000)，4 ℃過夜。次日取出蛋白條帶，TBST洗4次，每次10 min，室溫孵育二抗(稀釋比例為15 000)2 h。經過化學發光法顯影，用Image J軟件測量灰度值后分析各組差異性。

2.5 siRNA轉染A549細胞后EMT相關蛋白表達水平的檢測將狀態較好的A549細胞以2×105個/孔的密度接種于6孔細胞培養板中，放入恒溫培養箱(37 ℃、5%CO2)培養24 h，細胞密度達到60%后分別轉染空白質粒和siRNA-setdb1，轉染空白質粒和siRNA-setdb1的細胞分別培養6 h后加入ECC-JHF Ⅱ預處理12 h，TGF-β1誘導24 h后記為Nc+ECC-JHF Ⅱ組和si-setdb1+ECC-JHF Ⅱ組。未經處理的轉染后細胞分別記為NC組和si-setdb1組。提取蛋白，用Western Blot方法檢測EMT相關蛋白的表達。

2.6 染色質免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)技術檢測ECC-JHF Ⅱ對Snai1基因啟動子上H3K9me3水平的影響將狀態較好的A549細胞以2×105個/孔的密度接種于6孔細胞培養板中，分為空白組、TGF-β1組和ECC-JHF Ⅱ組，放入37 ℃、5%CO2恒溫培養箱培養24 h，細胞貼壁后生長密度達到80%時，ECC-JHF Ⅱ組給予ECC-JHF Ⅱ預處理12 h之后采用TGF-β1處理24 h；TGF-β1組給予TGF-β1處理24 h。通過甲醛交聯與超聲破碎細胞獲取樣本，加入與瓊脂糖共價結合的重組蛋白A、H3K9me3抗體、IgG抗體，4 ℃ 過夜。次日加入與瓊脂糖共價結合的重組蛋白A進行免疫復合物沉淀后，進行解交聯并回收DNA，通過qPCR測定目的基因含量。

3 結果

3.1 ECC-JHF Ⅱ對A549細胞活力的影響CCK8結果顯示，與0 mg·L-1ECC-JHF Ⅱ組比較，122.5 mg·L-1ECC-JHF Ⅱ組細胞活力顯著降低(P<0.01)；3.83～61.25 mg·L-1ECC-JHF Ⅱ組細胞活力無顯著變化(P>0.05)，可選用該濃度范圍內的ECC-JHF Ⅱ進行后續實驗。見表1。

表1 ECC-JHF Ⅱ對A549細胞活力的影響

3.2 ECC-JHF Ⅱ濃度篩選與空白組相比，TGF-β1 組E-cadherin蛋白表達水平顯著下調(P<0.01)，N-cadherin、FN1、Vimentin和α-SMA蛋白表達水平顯著上調(P<0.01)；與TGF-β1組相比，61.25 mg·L-1ECC-JHF Ⅱ組及PFD組E-cadherin蛋白表達水平顯著上調(P<0.01)，N-cadherin、FN1、Vimentin和α-SMA蛋白表達水平顯著下調(P<0.01)，所以后續實驗ECC-JHF Ⅱ的使用濃度為 61.25 mg·L-1。見圖1，表2。

注：n=3；a:FN1、E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達圖；b:Vimentin、α-SMA的蛋白表達圖；A：空白組；B：TGF-β1組；C：30.63 mg·L-1 ECC-JHF Ⅱ組；D：61.25 mg·L-1 ECC-JHF Ⅱ組；E：91.88 mg·L-1 ECC-JHF Ⅱ組；F：PFD組

表2 不同濃度ECC-JHF Ⅱ對FN1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白表達的影響

3.3 ECC-JHF Ⅱ有效改善EMT相關蛋白及SETDB1、H3K9me3蛋白表達水平與空白組相比，TGF-β1組E-cadherin、SETDB1和H3K9me3蛋白表達顯著下調(P<0.01)，FN1、α-SMA、N-cadherin、Vimentin、Snai1蛋白表達顯著上調(P<0.01)；與TGF-β1組相比，ECC-JHF Ⅱ組和PFD組SETDB1、H3K9me3和E-cadherin蛋白表達顯著上調(P<0.01)，FN1、α-SMA、N-cadherin、Vimentin、Snai1蛋白表達顯著下調(P<0.01)。見圖2，表3-表4。

表3 ECC-JHF Ⅱ對FN1、α-SMA、Vimentin、N-cadherin蛋白表達的影響

注：a:FN1、α-SMA、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的蛋白表達圖；b:Snail、H3K9me3、SETDB1的蛋白表達圖；n=3；A：空白組；B：TGF-β1組；C：ECC-JHF Ⅱ組；D：PFD組

表4 ECC-JHF Ⅱ對Snai1、E-cadherin、SETDB1、H3K9me3蛋白表達的影響

3.4 不同時間作用下ECC-JHF Ⅱ對TGF-β1誘導的EMT相關蛋白表達的影響與空白組相比，12 h TGF-β1組、24 h TGF-β1組SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表達顯著下調(P<0.01)，Snail、FN1、N-cadherin蛋白表達顯著上調(P<0.01)；36 h TGF-β1組SETDB1、E-cadherin蛋白表達顯著下調(P<0.01)，FN1、Snai1、N-cadherin蛋白表達顯著上調(P<0.01)。與12 h TGF-β1組相比，12 h TGF-β1+ECC-JHF Ⅱ組SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表達顯著上調(P<0.01)，FN1蛋白表達顯著下調(P<0.01)；與24 h TGF-β1組相比，24 h TGF-β1+ECC-JHF Ⅱ組SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表達顯著上調(P<0.01)，Snai1、FN1、N-cadherin蛋白表達顯著下調(P<0.01)；與36 h TGF-β1組相比，36 h TGF-β1+ECC-JHF Ⅱ組E-cadherin蛋白表達顯著上調(P<0.01)，Snai1、N-cadherin蛋白表達顯著下調(P<0.01)。見圖3，表5。

表5 不同時間作用下ECC-JHF Ⅱ對EMT相關蛋白表達的影響

注：a:SETDB1、H3K9me3、Snail的蛋白表達圖；b:FN1、N-cadherin、E-cadherin、的蛋白表達圖；n=3；A：空白組；B：12 hTGF-β1組；C：12 hTGF-β1+ECC-JHF Ⅱ組；D：24 hTGF-β1組；E：24 hTGF-β1+ECC-JHF Ⅱ組；F：36 hTGF-β1組；G：36 hTGF-β1+ECC-JHF Ⅱ組

3.5 ECC-JHF Ⅱ改善TGF-β1誘導的Snai1啟動子上H3K9me3表達下調與空白組相比，TGF-β1 組Snai1啟動子上H3K9me3表達減少(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+ECC-JHF Ⅱ組Snai1啟動子上H3K9me3表達增加(P<0.01)。見圖4。

注：n=3；與空白組比較，1)P<0.05；與TGF-β1組比較，4)P<0.01

3.6 siRNA敲低SETDB1抑制ECC-JHF Ⅱ對EMT相關蛋白的改善作用與空白組相比，TGF-β1組SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表達顯著下調(P<0.01)，FN1、N-cadherin、Snai1蛋白表達顯著上調(P<0.01)；與TGF-β1組相比，ECC-JHF Ⅱ組SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表達顯著上調(P<0.01)，FN1、N-cadherin、Snai1蛋白表達顯著下調(P<0.01)；與Nc組相比，si-setdb1組SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表達顯著下調(P<0.01)，Snai1、FN1、N-cadherin蛋白表達顯著上調(P<0.05)；與Nc+ECC-JHF Ⅱ組相比，si-setdb1+ECC-JHF Ⅱ組SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表達下調(P<0.01)，Snai1、FN1、N-cadherin蛋白表達上調(P<0.01)。見圖5，表6。

注：n=3；A：空白組；B：TGF-β1組；C：Nc組；D：si-setdb1組；E：ECC-JHF Ⅱ組；F：Nc+ECC-JHF Ⅱ組；G：si-setdb1+ECC-JHF Ⅱ組

表6 si-setdb1抑制ECC-JHF Ⅱ對EMT相關蛋白表達的改善作用

4 討論

近年來，特發性肺纖維化發病率呈上升趨勢[11]。但目前治療策略十分有限，臨床推薦藥物吡非尼酮和尼達尼布也只能起到延緩肺纖維化進展的作用，無法阻止甚或逆轉其病理進程[12-13]。肺移植手術是其有效的治療手段，但存在肺源不足及費用昂貴等問題。由此，亟需加強本病的防治研究。

肺纖維化發病機制復雜，EMT是其關鍵病理機制之一。肺纖維化發生后，肺內有大量肺纖維化細胞灶形成[12]。肺纖維化灶主要由成纖維細胞和肌成纖維細胞組成，它們分泌的大量膠原成為異常沉積的細胞外基質的重要組成成分。研究發現，肺纖維化中約有1/3的成纖維細胞和肌成纖維細胞都經EMT形成[14]。EMT發生后，細胞骨架重排，上皮細胞由卵圓形變為成長梭狀，E-鈣粘蛋白等上皮細胞標志蛋白表達下調，N-鈣粘蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、纖維連接蛋白等間充質細胞標志蛋白表達增加[15]。

TGF-β1是誘導EMT發生的重要因子。在肺泡上皮細胞受到損傷后，機體為進行損傷修復而產生大量的致纖維化細胞因子，如TGF-β等。TGF-β與TGF-β Ⅱ型受體(TGF-βRⅡ)結合，募集并誘導Ⅰ型受體C端磷酸化，從而激活Smads，激活的Smad2/Smad3與受體分離后，與Smad4形成三聚體，并作為轉錄因子移位到細胞核內[16-17]。Smad3/4復合物響應TGF-β，靶向Snai1序列，激活Snai1的表達[18]。Snai1通過與Smad3/4協同作用，抑制E-cadherin等上皮細胞標志蛋白的表達，激活N-cadherin等間充質細胞標志蛋白的表達[19-20]。

表觀遺傳學修飾是指在不改變基因堿基序列的情況下，通過DNA或組蛋白的甲基化和乙酰化等引起可遺傳的基因功能改變，進而引起細胞表型變化[21]。目前關于肺纖維化發病過程中表觀遺傳調控作用的研究甚少。已有研究表明，抗纖維化基因的超甲基化和促纖維化基因的低甲基化是導致成纖維細胞大量生成和肺瘢痕形成的原因[22-23]。在EMT過程中，基因表達的重編程伴隨著組蛋白修飾的動態變化[24]。關于信號通路中相關因子的表觀遺傳學變化，特別是在EMT發生時如何控制EMT驅動基因的組蛋白修飾，研究較少。SETDB1作為轉移抑制因子，可通過與Smad2/3形成阻遏復合物抑制肺癌轉移，其在高度轉移性肺癌細胞中受到強烈抑制，恢復SETDB1的表達則抑制了絲狀偽足的形成、遷移和侵入[25]。此外，SETDB1可以抑制乳腺上皮細胞和癌細胞的EMT進程[10]。課題組前期研究顯示，SETDB1通過H3K9me3的表觀修飾可以直接調節Snai1的表達，驅動EMT基因重編程；TGF-β1誘導的A549細胞通過減弱SETDB1的表達以促進EMT的發生[26]。

中醫藥在肺纖維化的防治上有明顯優勢，中醫認為肺纖維化常見虛實夾雜或本虛標實之證，治療以扶正祛邪為要。黃云鑒等通過文獻研究發現，肺纖維化的治療以養肺化痰、益氣養陰、養肺清熱和活血通絡為主，使用清熱、活血、益氣類中藥的頻率較高[27]。中醫治療肺纖維化在臨床實踐中有許多有效方劑，如孔祥文[28]用血府逐瘀湯和丹參飲合二陳湯加減治療痰瘀互結型肺纖維化，以補肺湯及平喘固本湯加減治療肺纖維化后期肺腎氣虛證。臨床觀察顯示益氣活血固本方治療氣虛血瘀型肺纖維化臨床有效，能改善臨床癥狀并緩解肺功能下降[29]；益氣祛痰化瘀湯聯合西醫治療能減輕IPF氣虛兼痰瘀阻肺型患者胸悶、咳嗽、氣短等主要癥狀，改善肺功能[30]；“氣陰兩補”法治療肺纖維化臨床效果較好，能有效降低炎癥因子水平，改善患者肺功能[31]。

李建生教授基于肺纖維化“正虛絡痹積損”病機，以補益肺腎、活血化痰為主要治法，擬定了金水緩纖方，該方能明顯提高患者生存質量，減緩疾病進展。課題組在此基礎上通過組分優化配伍獲得了與之療效相當的金水緩纖組分方Ⅱ[5]。金水緩纖組分方Ⅱ能有效改善肺纖維化并減輕上皮細胞間質化[5]；并可通過激活mTOR和自噬，抑制巨噬細胞的極化，從而減緩博來霉素誘導的大鼠肺纖維化[32]。金水緩纖組分方Ⅱ中的單體成分具有抑制上皮間質轉化、成纖維細胞活化及抗氧化作用。其中，淫羊藿苷可抑制TGF-β1誘導的人支氣管上皮細胞EMT，從而抑制氣道重塑[33]。川陳皮素抑制TGF-β1誘導的A549細胞EMT，抑制細胞侵襲轉移并抑制Snai1的表達[34]。異甘草素通過激活Nrf2的表達，發揮抗氧化作用[35]，還可通過激活MRC-5細胞的自噬作用，抑制TGF-β1誘導的成纖維細胞活化[36]。貝母素甲具有抗炎、抗癌、治療急性肺損傷的作用[37]；芍藥苷可通過增加E-cadherin表達，降低Snai1和α-SMA的表達，抑制TGF-β1引起的A549細胞EMT[38]，并可減輕博來霉素引起的小鼠肺纖維化[39]。

本實驗研究結果顯示，金水緩纖組分方Ⅱ可通過增加SETDB1的表達，上調Snai1啟動子上的H3K9me3水平，抑制Snai1及N-鈣粘蛋白、波形蛋白、纖維連接蛋白、α-平滑肌肌動蛋白等間質細胞標志蛋白的表達、促進E-鈣粘蛋白的表達，從而緩解EMT。為驗證SETDB1在其中是否起關鍵作用，用siRNA沉默SETDB1基因的表達，觀察金水緩纖組分方Ⅱ對EMT的抑制作用是否受到影響。結果顯示，敲低SETDB1表達后，金水緩纖組分方Ⅱ緩解TGF-β1誘導的上皮間質轉化作用受到抑制，這表明SETDB1對Snai1的表觀調控作用在金水緩纖組分方Ⅱ抑制TGF-β1誘導的A549細胞EMT的過程中起了關鍵作用。本研究為從細胞層面進一步闡釋金水緩纖組分方Ⅱ治療肺纖維化的作用機制提供了實驗依據。

綜上，金水緩纖組分方Ⅱ可通過調控SETDB1/Snai1表現抑制A549細胞的上皮間質轉化。本研究從表觀遺傳學角度闡釋了金水緩纖組分方Ⅱ通過組蛋白甲基化修飾抑制Snai1表達，進而抑制上皮細胞間質轉化的機制。由于研究中使用的A549細胞不能完全代表正常的人肺泡上皮細胞，后續研究可在其他細胞系或基因敲除小鼠中進行進一步驗證。