益腎活血丸調控Wnt7a/HOXA10改善內膜容受性的機理研究*

何東杰，衛愛武，許麗綿，馮倩怡

1.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000； 2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510006

不孕癥的發病率呈逐年上升趨勢，能否成功妊娠是由胚胎質量及具備接受胚胎能力的內膜協同作用決定的。子宮內膜容受性是指子宮內膜對胚胎的接受能力，每個月經周期子宮內膜僅在短暫的特殊時期具備允許胚胎植入的能力，這一時期稱為“種植窗期”[1]。隨著體外受精-胚胎移植助孕技術的迅猛發展，胚胎質量得到明顯的提高，但低種植率仍是生殖醫學領域尚未解決的瓶頸問題。子宮內膜容受性下降臨床主要表現為不孕癥、反復種植失敗等，因此，改善子宮內膜容受性成為提高胚胎種植率的關鍵因素，但目前對于改善子宮內膜容受性的治療尚缺少一致、公認的理想藥物和明確的治療方案。中醫學者們臨證多采用補腎活血法改善子宮內膜容受性，獲得良好的臨床療效[2-3]。同樣，大量的研究顯示，通過改善子宮內膜厚度、血流、胞飲突及調控整合素αVβ3、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)、同源盒基因A10(homoboxA10，HOXA10)、雌孕激素等的表達可提高內膜容受性[4-13]。敲除Wnt7a基因時子宮內膜不能生成腺體，上皮出現層疊現象，間質中HOXA10基因表達缺失，引起不孕，因此推測Wnt7a可參與胚胎著床[14-19]，但其作用機制尚需進一步研究。基于此，課題組進行了補腎活血法調控Wnt7a/HOXA10改善內膜容受性作用機理的探討，為該法在臨床中的應用提供理論研究基礎。

1 材料

1.1 動物50只SPF級雌性SD大鼠，10～12周齡，體質量為(220±20) g；20只SPF級雄性SD大鼠，8～10周齡，體質量為(320±20) g，購買于廣州中醫藥大學實驗動物中心，動物質量合格許可證號：SCXK(粵)2008-0020。大鼠飼養在廣州中醫藥大學SPF級動物實驗室，動物實驗環境設施合格許可證號：SCXK(粵)2008-0001，室內保持20～25 ℃，自由飲水、進食，采用12 h/12 h 晝夜交替。

1.2 藥物益腎活血丸(廣州中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，批準文號：粵Z20071211)；羥基脲片(規格：每片500 mg，齊魯制藥有限公司，生產批號：H37021289)；腎上腺素注射液(規格：1 mL1 mg，天津金耀氨基酸有限公司，生產批號：H12020526)；米非司酮片(規格：每片10 mg，北京紫竹藥業有限公司，生產批號：H20010633)。Trizol(美國Ambion公司，貨號：15596-026)；DEPC-treated 水(加拿大Fermentas公司，貨號：R0603)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis 試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號：K1621)；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix[東洋紡(上海)生物科技有限公司，貨號：QPK-201]；蛋白標準品Marker、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白含量檢測試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒、蛋白質考馬斯亮藍(R-250)染色檢測試劑盒、麗春紅染色液、PVDF膜(南京凱基生物科技發展有限公司，貨號：KGM431、KGPBC、KGP113、KGP1003、KGP105、KGP114)；放射性免疫沉淀法分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0013C)；化學發光試劑(A和B)(美國Millipore公司，貨號：WBKLS0050)；Wnt7a兔抗大鼠一抗、HOXA10兔抗大鼠一抗、通用型WB抗體稀釋液、兔抗大鼠IgG標記二抗(北京博奧森生物技術有限公司，貨號：bs-6645R、bs-2502R、C05-07001、C05-07002)；Streptavidin-HRP試劑盒(康為世紀生物科技股份有限公司，貨號：CW2069S)。

1.3 儀器ABI 3900型高通量DNA合成儀、AB7500型實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；NANO DROP 2000型超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)；9700型PCR擴增儀(美國ABI公司)；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；Vortex-Genie 2型漩渦振蕩器(美國Scientific Industries公司)；PB602-N型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；pHS-2型pH計(上海分析儀器廠)；LKB2127型恒壓恒流電泳儀(瑞典LKB公司)；902型超低溫冰箱(美國Forma公司)；PROTRAN Ⅱ型SDS-PAGE垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)；DU800型核酸蛋白質分析儀(美國Beckman公司)；TS-2000A型多用脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；BioPhotometer PLUS型生物分光光度計(德國Eppentoff公司)；P70F23P-G5(SO)型微波爐(廣東格蘭仕集團有限公司)；BS-3000A型顯微鏡(日本OLUMPUS公司)。

2 方法

2.1 藥物制備益腎活血丸的成人每日用量為 18 g，采用人與動物的體表面積計算法換算，大鼠的用藥等效劑量是1.733 g·kg-1·d-1(人與大鼠的體表面積分別按照許文生氏公式和Meeh-Rubner氏公式計算，成人與大鼠的平均體質量分別按55 kg和220 g計算)。將益腎活血丸研細粉溶于蒸餾水中，水浴加熱并攪拌至完全溶解，配成益腎活血丸溶液。米非司酮片研細粉后溶解于無水乙醇，然后懸浮于食用油溶液，配成米非司酮溶液。

2.2 動物分組、造模及給藥SPF級雌性大鼠隨機分為正常組、模型組、益腎活血丸組、米非司酮組、米非司酮+益腎活血丸組，每組10只。行陰道涂片觀察雌性大鼠動情周期，自動情間期開始用藥造模。模型組及益腎活血丸組以450 mg·kg-1·d-1劑量灌胃給予羥基脲，每天1次，每次2 mL，連續給藥10天；并于第4天開始于大鼠的頭頸部多點皮下注射腎上腺素0.3 mg·kg-1·d-1，每天1次，連續7 d，復制腎虛血瘀-子宮內膜容受性不良大鼠模型[20]。其余組大鼠首先給予同體積生理鹽水灌胃，每天1次，每次2 mL，共10 d，同樣第4天開始于大鼠頭頸部多點皮下注射等量生理鹽水，每天1次，共7天。第11天開始每晚1800雌雄大鼠11合籠，次晨800發現陰栓或陰道涂片發現精蟲者，確定為妊娠第1天。米非司酮組及米非司酮+益腎活血丸組大鼠于妊娠第3天上午900頭頸部多點皮下注射米非司酮溶液5 mg·kg-1，給藥體積 0.5 mL，復制胚胎著床障礙動物模型[21]。其余組大鼠頭頸部多點皮下注射等體積的乙醇油溶劑。自妊娠第1天開始益腎活血丸組及米非司酮+益腎活血丸組大鼠以1.733 g·kg-1·d-1劑量給予益腎活血丸溶液灌胃，其余組給予蒸餾水灌胃，每天1次，每次 2 mL。于妊娠第5天上午900，各組隨機抽取8只大鼠麻醉后，取子宮組織并立即用無菌錫紙包裹后于-80 ℃冰箱冷凍保存備用。

2.3 實時熒光定量PCR檢測子宮內膜組織中HOXA10mRNA、Wnt7amRNA的水平采用Trizol試劑提取各組大鼠子宮組織的總RNA，取4 μg RNA 采用逆轉錄試劑盒轉錄為cDNA，實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增。反應程序：95 ℃，60 s→PCR循環(×40循環)→95 ℃，15 s→60 ℃，60 s→溶解曲線分析→70 ℃～95 ℃讀板，每0.25 ℃讀板一次。每個樣本均進行三個復孔檢測，根據PCR反應信號強度的循環閾值 (threshold cycle，Ct)值進行計算，目的基因相對表達量ΔCt=目的基因Ct-GAPDH Ct，每個樣本的ΔCt值為該樣本三個復孔ΔCt的平均值；ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt，本研究對照組ΔCt為正常組各樣本ΔCt平均值；目的基因的相對表達量=2-ΔΔCt。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.4 Western Blot檢測子宮內膜組織中HOXA10、Wnt7a的蛋白表達水平提取各組大鼠子宮組織總蛋白，按照BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書操作步驟測定各蛋白濃度，蛋白定量后，上樣進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上。采用TBS漂洗PVDF膜5 min后放入封閉液中，4 ℃孵育一抗(HOXA10、Wnt7a、GAPDH稀釋比例為1500、1500、11 500)，置于搖床上過夜且平緩搖動。置于搖床上室溫平緩搖動2 h進行二抗孵育(稀釋比例12 500)，化學發光、顯影，定影并拍攝膠片，應用凝膠圖像處理系統對圖片灰度進行分析。目的蛋白相對表達量為目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值。

2.5 免疫組織化學技術檢測子宮內膜組織Wnt7a、HOXA10蛋白的表達載玻片經清潔液處理后沖洗干凈，55～60 ℃烤箱烘烤2 h備用。蠟塊制備及切片→石蠟切片常規脫蠟、水化→抗原修復→染色→滴加HOXA10或Wnt7a蛋白一抗工作液(1400)，封閉室溫下孵育1 h后4 ℃過夜→加入適量的生物素標記羊抗兔二抗工作液，在室溫下孵育10 min后采用PBS淋洗充分，滴加HRP標記的鏈霉親和素，室溫下孵育10 min后PBS淋洗，加入100 μL現配的DAB顯色溶液，顯色3～5 min，蘇木精復染1～3 min，自來水沖洗并分色(1%鹽酸酒精)，脫蠟、透明(75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度浸泡)、脫水干燥片，二甲苯透明后進行干燥，應用中性樹膠封片。顯微鏡下進行觀察并采用北航病理圖像分析軟件Med 6.0進行圖像分析，選取陽性單位(positive unit，PU)值進行統計學分析。

3 結果

3.1 益腎活血丸對各組大鼠子宮內膜組織Wnt7amRNA、HOXA10mRNA表達的影響與正常組比較，模型組、米非司酮組大鼠子宮內膜Wnt7amRNA、HOXA10mRNA的表達量均顯著下降(P<0.05)。與模型組比較，益腎活血丸組大鼠子宮內膜Wnt7amRNA、HOXA10mRNA表達量顯著升高(P<0.05)；米非司酮+益腎活血丸組大鼠子宮內膜組織Wnt7amRNA表達量顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 益腎活血丸對各組大鼠子宮內膜組織Wnt7a mRNA、HOXA10 mRNA表達的影響

3.2 益腎活血丸對各組大鼠子宮內膜組織Wnt7a、HOXA10蛋白表達的影響與正常組比較，模型組、米非司酮組大鼠子宮內膜HOXA10、Wnt7a蛋白表達量顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，益腎活血丸組及米非司酮+益腎活血丸組大鼠子宮內膜HOXA10、Wnt7a蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與米非司酮組比較，益腎活血丸組大鼠子宮內膜HOXA10、Wnt7a蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，而米非司酮+益腎活血丸組大鼠子宮內膜HOXA10、Wnt7a蛋白表達量有升高趨勢，但無顯著差異(P>0.05)。見表3，圖1。

表3 益腎活血丸對各組大鼠子宮內膜組織Wnt7a、HOXA10蛋白表達的影響

注：A：模型組；B：米非司酮組；C：益腎活血丸組；D：米非司酮+益腎活血丸組；E：正常組

3.3 益腎活血丸對各組大鼠子宮內膜Wnt7a、HOXA10分布情況的影響著床期HOXA10在子宮內膜腺體與間質中表達豐富，以間質為主，主要表現為細胞胞漿著色，部分胞核也有著色，以出現棕黃色顆粒為陽性；Wnt7a在子宮內膜腔上皮與腺體表達，間質幾乎沒有表達，主要表現為細胞胞漿著色，胞核幾乎無著色，以出現棕黃色顆粒為陽性。正常組大鼠子宮內膜HOXA10與Wnt7a表達豐富。與正常組比較，模型組與米非司酮組大鼠子宮內膜HOXA10、Wnt7a蛋白陽性表達量明顯減少，PU值顯著下降(P<0.05)。與模型組比較，益腎活血丸組大鼠子宮內膜HOXA10、Wnt7a蛋白陽性表達量明顯增多，PU值明顯升高(P<0.05)；米非司酮+益腎活血丸組大鼠子宮內膜組織中HOXA10蛋白陽性表達增多，PU值明顯升高(P<0.05)。與米非司酮組比較，米非司酮+益腎活血丸組大鼠子宮內膜HOXA10與Wnt7a蛋白陽性表達量增多，PU值升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表4,圖2-圖3。

表4 各組大鼠免疫組化陽性目標PU值

圖2 免疫組化檢測各組大鼠HOXA10的蛋白表達水平(×400)

圖3 免疫組化檢測各組大鼠Wnt7a的蛋白表達水平(×400)

3.4 子宮內膜HOXA10與Wnt7a表達的相關性分析相關性分析結果顯示：子宮內膜HOXA10mRNA與Wnt7amRNA之間呈高度正相關(r=0.885，P=0.000<0.01)；HOXA10蛋白與Wnt7a蛋白表達呈正相關關系(r=0.883，P=0.000<0.01)；HOXA10與Wnt7a蛋白陽性目標PU值呈高度正相關關系(r=0.841，P=0.000<0.01)。見圖4-圖6。

圖4 HOXA10 mRNA與Wnt7a mRNA相對表達量的相關性分析

圖5 HOXA10與Wnt7a 蛋白相對灰度值相關性分析

圖6 HOXA10與Wnt7a 陽性目標PU值相關性分析

4 討論

子宮內膜的發育依賴精血的充養，正如《傅青主女科》云：“ 精滿則子宮易于攝精，血足則子宮易于容物”。腎為先天之本，元氣之根，主藏精氣，既藏先天之精，又藏后天水谷之精，為生殖發育之本源，能系胎載胎，固攝胎元。精血同源，《諸病源候論》曰：“腎藏精，精者，血之所成也”；《馮氏錦囊秘錄》云：“氣之根，腎中之真陽也；血之根，腎中之真陰也”，可見腎精是子宮內膜生長發育及發揮功能的物質基礎，在生殖中發揮著主導作用。臨證中亦發現，子宮內膜容受性不良患者以腎虛為多見，根據中醫腎主生殖及女子以血為本的理論，無論腎氣虛、腎陰虛、腎陽虛均可導致血行不暢而致血瘀，影響內膜容受性，故認為腎虛血瘀是子宮內膜容受性不良患者的主要病理特征，因此，在臨床中應采用補腎活血中藥進行治療。益腎活血丸由枸杞子、益智仁、菟絲子、熟地黃、女貞子、金櫻子、桃仁、當歸、茺蔚子、甘草組成，運用補腎填精、滋陰生血之品促進精血生成，充養內膜，促進內膜發育，氣形生成；采用活血化瘀藥物改善胞宮微循環，促進血管分化，氣血充足。氣血充足，氣形生長，方能形成有能力接受胚胎的子宮內膜。

每個月經周期僅在短暫的特殊時期子宮內膜具備允許胚胎植入的能力，在這特定窗口期前后，子宮內膜對胚胎處于不容受階段。在子宮內膜容受這一變化過程中，類生長因子、細胞因子、黏附分子及蛋白等因素共同構成了胚胎植入的分子基礎[22-24]，這其中任何一個或幾個因素表達異常，都有可能引起子宮內膜微環境發生改變，影響內膜容受性，從而導致胚胎著床失敗、不孕等。

著床窗口期子宮內膜HOXA10的表達可作為評價內膜容受性的指標。HOXA10基因是一種同源框轉錄調節因子，主要在子宮內膜上的腺細胞和基質細胞中表達，隨著月經周期的變化呈周期性變化，在分泌中期、晚期的表達較增殖早期、晚期的表達明顯升高，且其在子宮內膜基質細胞的表達較腺細胞升高，是胚胎著床和子宮內膜蛻膜化必不可少的基因。HOXA10基因主要通過與下游靶基因DNA結合激活或抑制目的基因而發揮作用，缺失HOXA10的小鼠正常排卵，但胚胎不能成功著床；缺失HOXA10的胚胎可在正常小鼠子宮內成功著床，而正常小鼠的胚胎在缺失HOXA10小鼠的子宮內膜上著床失敗；阻斷小鼠HOXA10的表達引起著床障礙[25]。由此可見，HOXA10參與胚胎著床，與子宮內膜容受性關系密切，而與胚胎發育無關。研究表明，多囊卵巢綜合征、子宮腺肌癥及子宮內膜息肉等不孕癥相關疾病患者子宮內膜中HOXA10基因的表達均明顯低于正常人[26-28]。HOXA10基因通過調控靶基因LIF、EMX2、αvβ3 、IGFBP-1、FKBP52、PCAF、Calpain5等影響子宮內膜容受性[29-37]。可見，HOXA10基因是調控子宮內膜容受性、維持正常妊娠的關鍵基因。以HOXA10為切入點研究子宮內膜容受性的機制已成為生殖界的熱點。本研究發現，HOXA10在著床期子宮內膜腺體與間質中均表達豐富，以間質為主；在子宮內膜容受性不良模型大鼠子宮內膜表達顯著降低，益腎活血丸能明顯提高腎虛血瘀子宮內膜容受性不良模型大鼠子宮內膜HOXA10的表達。推測益腎活血丸通過調控子宮內膜HOXA10的表達改善子宮內膜容受性。

同樣，著床窗口期子宮內膜Wnt7a的表達亦可作為評價內膜容受性的指標。Wnt信號傳導途徑是調控細胞生長、發育和分化的關鍵途徑，是一個多環節、多作用位點的生長發育調控信號通路，在動物胚胎發育和腫瘤發生中起著重要作用。Wnt家族中的Wnt7a在子宮內膜的表達隨著月經周期呈現周期性變化，分泌期呈現高表達[14]。Wnt7a在子宮內膜中特征性表達及在種植窗口期的高表達，提示Wnt7a可能在胚胎著床中發揮重要作用。研究表明，Wnt7a可通過經典的β-catenin途徑調控子宮內膜容受性，Wnt7a基因敲除小鼠子宮內膜無腺體生成，內膜上皮呈現層疊現象，內膜間質中HOXA10基因表達缺失，最終導致不孕[15-16]。本研究發現，Wnt7a在著床期子宮內膜腔上皮與腺體表達豐富，間質幾乎沒有表達；在子宮內膜容受性不良模型大鼠子宮內膜表達顯著降低，益腎活血丸能明顯提高腎虛血瘀子宮內膜容受性不良大鼠模型子宮內膜Wnt7a的表達。推測益腎活血丸通過升高子宮內膜Wnt7a的表達改善子宮內膜容受性。此外，本研究還發現Wnt7a和HOXA10在著床期子宮內膜的表達呈高度正相關，結合后文獻研究推測，益腎活血丸通過升高子宮內膜Wnt7a的表達，促進HOXA10的表達，進而改善子宮內膜容受性。

綜上，益腎活血丸能升高子宮內膜容受性不良大鼠子宮內膜Wnt7a、HOXA10的表達，提高子宮內膜容受性，療效確切，本研究為補腎活血法在臨床中的應用提供實驗研究基礎。