我國主要流行的4種血清型禽腺病毒-I群感染SPF雞的致病性比較研究

王建琳,江之瑤,欒慶東,尹燕博*

(1.青島農業大學動物醫學院，青島 266109；2.青島博隆基因工程公司，青島 266041)

禽腺病毒-I群(fowl adenoviruses，FAdVs)感染與多種疾病有關，如肌胃糜爛、心包積液綜合征(hydropericardium syndrome，HPS)和包涵體肝炎(inclusion body hepatitis，IBH)。根據病毒的分子結構特征，FAdVs 可分為5個種，分別為A、B、C、D和E；根據血清交叉中和反應，可分為12個血清型(FAdVs 1～7、8a、8b、9～11)。其中，肌胃糜爛主要與FAdV-1相關，盡管也有零星報道臨床肌胃損傷病例中分離到FAdV-8a和FAdV-8b；HPS主要由FAdV-4引起；IBH與FAdV-2、-8a、-8b和-11相關。近年來，FAdVs感染呈現全球增長趨勢，給肉雞養殖業造成嚴重的經濟損失。

2007―2017年的調查表明，我國主要流行FAdV-4、-8a、-8b和-11，且目前主要流行的血清型FAdVs與IBH和HPS相關。其中，2007—2014年，FAdV-11為主要流行血清型，引起IBH；從2014年7月以來，FAdV-4引起的HPS大量發生；2017年，臨床分離的FAdVs以FAdV-8b為主。目前，我國FAdVs的致病性研究主要集中到FAdV-4，其他血清型FAdVs的致病性多見于國外報道，且報道結果并不一致，如Steer等報道FAdV-8b感染SPF雞引起IBH，其死亡率為7%，但Matos等報道FAdV-8b感染SPF肉雞和蛋雞的死亡率分別為100%和20%。這表明同一血清型FAdVs不同毒株對SPF雞的致病性并不完全一致。

垂直傳播被認為是FAdVs的重要生物學特性，但并不是所有血清型FAdVs均可引起雞胚發生明顯損傷，如FAdV-2和 FAdV-11感染11日齡SPF雞胚不發生死亡且剖檢無明顯病變，但也有報道FAdV-11具有較高的雞胚致死率，FAdV-4和FAdV-8對雞胚的致死率為100%。這也表明，同一血清型FAdVs不同毒株對SPF雞胚的致病性并不完全一致。

鑒于同一血清型FAdVs不同毒株對SPF雞胚和雞的致病性存在差異，且我國主要流行的血清型FAdV-4、-8a、-8b和-11的致病性未見詳細研究報道，故本研究擬對這4種血清型FAdVs感染雞胚和雞的比較病理學進行研究，以期為FAdVs發病機制的研究提供基礎，為FAdVs感染的防控措施的制定提供依據。

1 材料與方法

1.1 毒株

FAdV毒株 KU981149(FAdV-4)、MF573907(FAdV-8a)、MF573909(FAdV-8b)和MF573929(FAdV-11)由本實驗室分離、鑒定和保存。

1.2 主要試劑與實驗動物

病毒基因組DNA提取試劑盒、小量膠回收試劑盒、多功能DNA純化回收試劑盒、克隆載體pMD19-T、DL2000 DNA Marker和感受態細胞DH5α均購自TaKaRa公司、DMEM/F-12 1∶1營養液購自Hyclone公司、胎牛血清購自Gibco公司。

12日齡SPF雞胚和10日齡SPF雞均購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.3 4種血清型毒株組織半數感染量測定

取4瓶(25 cm)LMH細胞，待細胞生長到約占瓶底面積的90%時，棄掉培養液，用PBS沖洗3次后，加入0.25%胰酶500 μL室溫消化3 min，消化完成后，加入一定量含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F-12 反復吹打，使細胞懸液中細胞量為(2～3)×10個·mL。取96孔細胞培養板，每孔加入細胞懸液100 μL，置于二氧化碳培養箱中37 ℃培養24 h。培養完成后倒出培養液，每孔加入用含2%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F-12 10倍比稀釋的細胞毒100 μL，每個稀釋度接種8孔，留陰性對照(加入不含細胞毒的DMEM/F-12)兩排，置于二氧化碳培養箱中37 ℃，培養7 d。記錄病變孔數，按Reed-Muench法計算組織半數感染量(the 50% tissue culture infective dose，TCID)。

1.4 4種血清型毒株感染SPF雞胚

12日齡SPF雞胚150枚，隨機分為5組，每組30枚，分別為FAdV-4組、FAdV-8a組、FAdV-8b組、FAdV-11組和對照組。各感染組雞胚經絨毛尿囊膜途徑接種10TCID300 μL病毒液，對照組接種等量的DMEM/F-12。將雞胚置于孵化器中孵化，每天檢查雞胚發育情況，棄去接種后24 h內死亡雞胚，接種后7 d統計各組雞胚死亡率，測定存活雞胚質量，觀察胚體變化。

1.5 4種血清型毒株感染SPF雞

150只10日齡SPF雞隨機分為5組，每組30只，分別經腿部肌肉途徑感染300 μL 10TCIDFAdV-4、600 μL 10TCIDFAdV-8a、600 μL 10TCIDFAdV-8b、600 μL 10TCIDFAdV-11 和600 μL DMEM/F-12。每天觀察SPF雞狀態，于感染后第5天統計各組死亡率，并每組隨機處死7只SPF雞進行病理剖檢，記錄各組病變并進行評分，無明顯病變為0，輕度損傷為1～2，中度損傷為3，嚴重損傷為4～5，各組SPF雞各器官評分進行相加。取重要組織和主要免疫器官用10%福爾馬林固定，進行HE染色和病理組織學觀察。

1.6 4種血清型毒株感染SPF雞主要臟器病毒載量測定

應用DNA提取試劑盒根據操作步驟提取各血清型FAdVs病毒DNA，根據Meulemans等報道的FAdVs基因擴增引物進行PCR擴增，擴增產物連接pMD19-T載體16 ℃過夜，后轉入DH5α感受態細胞中。經測序驗證后，正確的樣品大量搖菌培養后提取質粒，紫外分光光度計測定質粒濃度，并按照公式計算DNA拷貝數。將質粒樣品稀釋，用ddHO將質粒樣品依次稀釋成1×10～1×10copies·μL，將8個樣品梯度作為標準品模板進行熒光定量PCR，得到相應的值。以值作為縱坐標，相應模板濃度的對數作為橫坐標，制作標準曲線。同時制作熔解曲線，以檢驗熒光定量PCR程序的準確性。同時制作熔解曲線，以檢驗熒光定量PCR程序的準確性。

130只10日齡SPF雞隨機分為5組，FAdV-4組50只，其余各組每組20只，分別經腿部肌肉途徑感染300 μL 10TCIDFAdV-4、600 μL 10TCIDFAdV-8a、600 μL 10TCIDFAdV-8b、600 μL 10TCIDFAdV-11和600 μL DMEM/F-12。于感染后第3、5、7天每組隨機處死5只，采集心、肝、腎、胰、脾和法氏囊保存于-70 ℃。提取各組織總核酸進行熒光定量PCR測定，反應條件95 ℃ 5 min；35個循環，95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s和72 ℃ 20 s；參照試驗建立的標準曲線對檢測結果進行比較分析。

1.7 統計分析

數據采用SPSS 21.0 軟件進行分析，多組差異比較采用單因素方差分析，以<0.05 為差異顯著，<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 4種血清型毒株TCID50

LMH細胞在96孔細胞培養板中經病毒接種后觀察7 d，記錄出現細胞病變的孔數。根據細胞病變的孔數，根據Reed-Muench法計算，FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11的TCID分別為1×10·100 μL、1×10·100 μL、1×10·100 μL和1×10·100 μL。

2.2 4種血清型毒株感染SPF雞胚的研究結果

4種血清毒株感染雞胚后，FAdV-8a感染組雞胚最早開始死亡；感染后7 d FAdV-8a 感染組死亡率達到16.67%，FAdV-11感染組達到 86.67%，FAdV-4感染組為40%，FAdV-8b感染組為46.67%，對照組無死亡(圖1A)。雞胚感染后7 d，各感染組存活雞胚的質量均低于對照組，其中，FAdV-4 感染組質量減少最少，FAdV-8a 感染組質量顯著低于對照組(<0.05)(圖1B)。

A.雞胚存活率；B.雞胚胚體質量(*.P<0.05)

除胚體大小外，各感染組雞胚出現相似的變化，均出現胚體出血、蜷縮；胚肝出血、壞死、膽汁淤積，對照組雞胚無明顯變化(圖2)。

A1、A2.對照組；B1、B2.FAdV-4感染組；C1、C2.FAdV-8a感染組；D1、D2.FAdV-8b感染組；E1、E2.FAdV-11感染組

2.3 4種血清型毒株感染SPF雞的研究結果

FAdV-4感染組SPF雞在感染后2 d出現被毛蓬亂，FAdV-8b感染組SPF雞在感染后4 d出現精神沉郁現象。感染后5 d，FAdV-4感染組SPF雞死亡率達53.3%，而其他組均無死亡。剖檢可見，除FAdV-11感染組外，其他病毒感染SPF雞后均出現了肝脂肪變性、腫脹和出血，且FAdV-4 感染組最明顯；FAdV-4感染組和FAdV-8a 感染組SPF雞明顯出現腎腫大、顏色蒼白；FAdV-8b感染組和FAdV-11感染組出現胰腺壞死。此外，FAdV-4感染組、FAdV-8a感染組和 FAdV-8b感染組分別出現明顯的心包積液、肌胃糜爛和腺胃腫脹現象；對照組SPF雞各器官均無明顯病變(圖3)。

A1、A2、A3.對照組肝、肌胃腺胃和胰；B1、B2、B3.FAdV-4感染組肝、腎和心；C1、C2、C3.FAdV-8a感染組肝、腎和肌胃腺胃；D1、D2、D3.FAdV-8b感染組肝、肌胃腺胃和胰；E1、E2、E3.FAdV-11感染組肝、肌胃腺胃和胰

對各組SPF雞器官病變進行評分，FAdV-4 感染組SPF雞心、肝和腎損傷較明顯，FAdV-11感染組肝和胰腺出現明顯損傷，FAdV-8b 感染組胰腺、腺胃出現明顯損傷；FAdV-8a感染組和FAdV-8b 感染組肝和腎損傷評分相似(表1)。

表1 FAdV-4、-8a、-8b和-11感染組SPF雞主要器官損傷評價分數和

組織學觀察發現各感染組SPF雞肝出現相似變化，肝淤血、肝細胞變性和壞死，變性的肝細胞內出現核內包涵體，壞死區域出現大量炎性細胞浸潤，浸潤的細胞主要為淋巴細胞和巨噬細胞；此外，FAdV-11感染組血管周圍出現炎性細胞浸潤，FAdV-8a感染組部分膽管周圍出現炎性細胞浸潤，對照組肝組織無明顯病變(圖4 A1、B1、C1、D1和E1)。

FAdV-4、FAdV-8a和FAdV-8b感染組SPF雞腎損傷相似，主要出現輕度的淤血和腎小管上皮細胞變性，腎間質有大量淋巴細胞浸潤；此外，FAdV-4和FAdV-8a感染組出現腎小球炎，對照組腎組織無明顯病變(圖4 A2、B2、E2)。FAdV-8b 感染組SPF雞腺胃管狀腺上皮細胞壞死，間質大量炎性細胞浸潤(圖4 C2)；FAdV-11 感染組腺胃管狀腺間質有炎性細胞浸潤(圖4 D2)，對照組腺胃無明顯病變(圖4 F2)。

FAdV-4感染組SPF雞心外膜明顯增厚、肌纖維斷裂，存在水腫和大量炎性細胞浸潤現象，對照組心無明顯病變(圖4 A3、F1)。FAdV-8a感染組肌胃出現明顯損傷，角質層破壞，固有層內混雜有細胞碎片和異嗜性粒細胞，對照組肌胃無明顯損傷(圖4 B3、E3)。FAdV-8b 和FAdV-11感染組SPF雞胰腺腺泡細胞壞死，有大量吞噬細胞和淋巴細胞浸潤，對照組胰腺無明顯病變(圖4 C3、D3、F3)。

A1、A2、A3.FAdV-4感染組肝、腎和心；B1、B2、B3.FAdV-8a感染組肝、腎和肌胃；C1、C2、C3.FAdV-8b感染組肝、腺胃和胰；D1、D2、D3.FAdV-11感染組肝、腺胃和胰；E1、E2、E3.對照組肝、腎和肌胃；F1、F2、F3.對照組心、腺胃和胰。放大倍數：A1～2、B1～2、C1～2、D2均為400×;A3、B3、C3、D1、D3、E1～3、F1～3均為200×

免疫器官中感染組SPF雞脾白髓出現彌漫性實質細胞稀疏現象，FAdV-4感染組SPF雞脾出現淋巴細胞局灶性增生，FAdV-8a感染組脾紅髓內出現嗜伊紅染物質，FAdV-8b 感染組和FAdV-11 感染組出現廣泛的實質細胞壞死(圖5 A1、B1、C1和D1)。各感染組SPF雞胸腺均出現明顯損傷，皮質和髓質區域的淋巴細胞減少(圖5 A2、B2、C2和D2)。FAdV-8b 感染組和FAdV-11感染組胸腺髓質胸腺小體增多(圖5 C2、D2)，且FAdV-11感染組出現輕度淤血現象(圖5 D2)。FAdV-4感染組、FAdV-8a感染組和FAdV-11感染組濾泡髓質淋巴細胞明顯缺失(圖5 A3、B3和D3)。FAdV-8b 感染組法氏囊濾泡內細胞壞死，淋巴細胞局灶性增生(圖5 C3)，FAdV-8b 感染組和FAdV-11感染組法氏囊出現輕度充血(圖5B3和 5D3)。對照組SPF雞脾、胸腺和法氏囊無明顯病變(圖5 E1、E2和E3)。

放大倍數：A1～3、B2～3、C2～3、D2、E1～3均為200×;B1、C1、D1、D3均為400×

除FAdV-8a感染組外，FAdV-4感染組SPF雞心(圖6A)和腎(圖6C)病毒載量最高，FAdV-8b感染組和FAdV-11感染組SPF雞胰腺(圖6D)病毒載量高于FAdV-4感染組。FAdV-4感染組SPF雞心、肝(圖6B)和腎病毒載量在感染后第5天高于第3、7天，這與剖檢時觀察到的病理損傷程度相一致。FAdV-8b感染組和 FAdV-11感染組SPF雞脾(圖6E)和法氏囊(圖6F)病毒載量在感染后第3天高于FAdV-4感染組，且法氏囊病毒載量在各個時間點均高于FAdV-4感染組。FAdV-8a感染組SPF雞各器官病毒載量均較低(圖6)，這可能與該毒株的生物特性有關，有待進一步研究。

A.心；B.肝；C.腎；D.胰腺；E.脾；F.法氏囊。*.P<0.05; **.P<0.01

3 討 論

目前，FAdVs大部分血清型毒株感染雞都會造成肝損傷或心包積液等，且臨床感染在多個國家呈現增加趨勢，給家禽養殖業造成巨大經濟損失。尤其是2014年以來，我國出現FAdV-4感染引起HPS，其死亡率高達20%～70%；雖然研究報道FAdV-8a、-8b和-11感染SPF雞出現IBH，不會造成死亡，但臨床IBH嚴重程度通常由于雞傳染性法氏囊病毒或雞傳染性貧血病毒等免疫抑制性病原混合感染的影響而各異，且近年來臨床病死雞中FAdVs的分離率明顯增加。鑒于不同血清型FAdVs感染給我國養雞業造成嚴重影響，有必要對我國主要流行血清型FAdVs對雞的致病性進行詳細研究。

FAdVs毒株可通過雞胚肝細胞、雞胚腎細胞、LMH細胞或雞胚進行分離，本研究應用LMH細胞進行病毒的增殖和病毒滴度的測定，LMH細胞感染后出現明顯的細胞病變。研究報道，FAdVs在雞胚中增殖并不一定會引起明顯病變，本研究不同血清型FAdVs感染雞胚后均出現明顯死亡，且存活雞胚的胚體質量明顯降低，其中，FAdV-11感染雞胚死亡率達86.67%，FAdV-8a感染雞胚死亡率最低為16.67%；FAdV-8a感染對雞胚胚體質量影響最嚴重，而FAdV-4感染最輕。不同血清型FAdVs感染雞胚后出現相似的損傷現象，與Schachner等的報道一致，胚體蜷縮和出血，肝出血、壞死、膽汁淤積等現象。垂直傳播被認為是FAdVs感染的主要特征，這表明，與其他血清型毒株相比，種雞感染FAdV-11、-8a后會導致雞胚的孵化率降低或出現弱雛。

自從2014年以來，大量研究報道集中于FAdV-4引起HPS。本研究為確保FAdV-4感染后SPF雞出現明顯癥狀，但不會在感染后1～2 d內死亡，進行前期試驗研究確定病毒感染量，感染后的死亡率達53.3%，其他血清型FAdVs感染不引起SPF雞死亡。肝和腎為FAdVs感染損傷的主要器官，出現肝炎和腎小球腎炎。4種血清型FAdVs感染SPF雞后，FAdV-4感染雞肝和腎損傷最明顯，FAdV-11感染雞最輕微，且損傷程度與病毒載量多少相一致。盡管FAdV-4對SPF雞的致病性最強，但也不能忽略FAdV-8a和FAdV-11對雞胚的致病性。綜合本研究結果，認為不同血清型FAdVs對雞胚和雞的致病性并不一致，即對雞胚的致病性強并不代表對雞的致病性強。

除肝和腎的損傷外，不同血清型毒株具有其損傷的特異靶器官。FAdV-4感染后導致SPF雞出現心包腔積液，心外膜和心肌間間隙增寬，充滿炎性細胞，這被認為是HPS的重要病理特征。肌胃糜爛被認為是FAdV-1感染的重要特征，本研究發現 FAdV-8a 感染雞出現明顯雞肌胃糜爛，且異嗜性粒細胞浸潤，這與日本和埃及的兩項研究報道相一致。腺胃炎是FAdV-8b感染SPF雞的重要特征，這與前期實驗室從臨床腺胃炎病例種分離到 FAdV-8b的結果相一致。FAdV-8b和FAdV-11感染雞出現胰腺多灶狀壞死，Nakamura等曾報道FAdV-4感染肉雞胰腺出現白色壞死灶，Okuda等報道從臨床無明顯眼觀病變雞的胰腺分離到FAdV-8。胰腺、腺胃和肌胃的損傷必將影響到胰液和消化酶的分泌及消化功能，盡管這種損傷不會導致雞的死亡，但將會影響雞的飼料轉化、生長發育，從而給養雞業造成嚴重經濟損失。

以前研究認為，引起HBH的幾種血清型FAdVs并不會作為病原單獨感染引起疾病，通常是在免疫抑制性病毒感染后繼發感染而引起IBH。實際上，大部分FAdVs不僅具有致病性，且具有免疫抑制的可能性。FAdV-4、-8a和-11感染后引起機體免疫器官，如脾、胸腺和法氏囊出現退行性變化。本研究發現 FAdV-8a、-8b和-11感染雞引起的免疫器官內淋巴細胞缺失和損傷較FAdV-4更為嚴重，且除FAdV-8a外，脾和法氏囊的病毒載量高低與損傷程度相一致。這表明，FAdV-8a、-8b和-11感染盡管對雞無致死性，但可導致雞出現免疫抑制，這將會導致其他病原的繼發感染，造成較大的經濟損失。

本研究中與其他血清型FAdVs相比，FAdV-8a感染SPF雞胚的死亡率最低，但對胚體質量影響最大；感染LMH細胞出現病變最早，免疫熒光染色病毒陽性信號出現最早(數據未報道)，感染SPF雞胚出現死亡最早，但各組織病毒載量最低。FAdV-8a毒株的這一特殊生物學特性有待于進一步研究。

4 結 論

首次對我國主要流行的4種血清型FAdVs對雞的致病性進行比較病理學研究，結果表明，FAdVs對雞胚的致病性強弱并不能代表其對SPF雞的致病性；且與FAdV-4相比，雖然FAdV-8a、-8b和-11感染不會造成雞的死亡，但對雞胚具有較強的致死性和減輕胚體質量，造成雞胰腺、腺胃、肌胃和免疫器官嚴重損傷。故FAdV-8a、-8b和-11對養雞業的影響也應引起足夠重視。