細粒棘球絳蟲BAG3和EB1基因的克隆、表達及其在原頭蚴細胞凋亡中的作用

何 雪，王 凝，華瑞其，杜小迪，楊光友

(四川農業大學動物醫學院，成都611130)

細粒棘球絳蟲()屬于帶科()棘球屬()，其中絳期幼蟲寄生于人和多種動物的組織器官內時會引起囊型包蟲病(cystic echinococcosis, CE)。該病呈世界性分布，南美、東歐、中東、南非、亞洲以及地中海地區為主要流行區域，其中，中國也是全球范圍內包蟲病流行最為嚴重的國家之一，造成巨大的經濟損失和公共衛生安全問題。囊型包蟲病的主要特征是在肝、肺等組織器官內形成多個大小不等的包囊，包囊由囊壁和囊液組成。囊壁包括內部的生發層(germinal layer)和外部的角質層(laminated layer)。此外，囊壁外還有一層致密的纖維組織層(adventitial layer)。包囊分為育囊和不育囊，育囊內含大量的原頭蚴，不育囊內無原頭蚴存在，因此不育囊不能感染終末宿主，但仍能對中間宿主組織器官造成嚴重損傷。目前，不育囊的形成機制尚不明確，但有研究顯示細胞凋亡可能與不育囊形成之間有著密切聯系，因此，調控細胞凋亡的相關基因可能在此過程中起至關重要的作用。

BAG3屬于Bcl-2結合抗凋亡基因(Bcl-2 associated athanogene，BAG)家族，該家族的成員均含有一個位于C端的BAG結構域，BAG蛋白通過該結構域可與熱休克蛋白70(heat shock protein, HSP70)的ATP酶結構域結合，作為HSP70的共-分子伴侶從而發揮抗細胞凋亡的作用。內吞蛋白B1(endophilin B1，EB1)，又稱作Bax蛋白互作因子 1(Bax-interacting factor 1, Bif-1)，為內吞蛋白家族(endophilin)的一員，廣泛參與細胞凋亡、自噬、線粒體功能調控等細胞生理學過程，EB1蛋白作為Bax蛋白的激活因子，目前其促凋亡作用已被研究證實。細粒棘球絳蟲基因組中存在BAG3和EB1基因，但目前尚無細粒棘球絳蟲BAG3和EB1基因功能的研究報道，二者在蟲體細胞凋亡過程中是否具有調控作用也不清楚。為此，本研究通過克隆、表達了Eg-BAG3和Eg-EB1基因，對其蛋白分子特性及其在原頭蚴細胞凋亡中的作用進行了探究，以期為細粒棘球蚴不育囊的形成機制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

動物組織總RNA提取試劑盒、質粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒、大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態細胞購自北京天根生物科技有限公司；PrimeScriptDouble Strand cDNA Synthesis Kit、pMD19-T載體、限制性內切酶(H Ⅰ、R Ⅰ、Ⅰ)及T4 DNA連接酶購自大連寶生物工程有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自瑞士Roche公司；總蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物科技公司；HRP Conjugated Goat Anti-rabbit IgG(H+L)及FITC Conjugated Goat Anti-rabbit IgG(H+L)購自武漢博士德生物工程有限公司；RNA轉染試劑EntransterTM-R4000、RPMI1640培養基及胎牛血清分別購自上海吉瑪制藥技術有限公司和美國Hyclone公司；pET-28a(+)、pET-32a(+)載體和弗氏(不)完全佐劑分別購自美國Invitrogen和Sigma公司；Ni親和層析柱和HiTrap Protein A預裝柱購自美國Bio-Rad公司。PCR引物合成及質粒測序交由上海生工生物工程有限公司完成，siRNA由上海吉瑪公司合成。免疫印跡對照蛋白：西氏貝蛔蟲()重組硫氧還蛋白過氧化物酶(rBs-Tpx)由四川農業大學動物寄生蟲病研究中心提供。

1.2 動物倫理學聲明

本研究得到四川農業大學動物倫理委員會的審查和批準，所有實驗動物的飼養及試驗操作程序嚴格按照“四川農業大學動物倫理委員會實驗動物護理指南”(SYXK2014-187，中國成都)的相關規定進行。

1.3 蟲體、血清及動物

細粒棘球蚴包囊采自四川某屠宰場自然感染囊型包蟲病綿羊的肝或肺。在實驗室無菌條件下利用無菌注射器抽出包囊液并于普通光學顯微鏡下進行鏡檢，根據是否含有原頭蚴將包囊鑒定為育囊和不育囊，隨后將從育囊中獲得的囊液經4 000 r·min離心10 min，無菌PBS清洗3次后分離得到原頭蚴。細粒棘球絳蟲45日齡成蟲由四川農業大學動物寄生蟲病研究中心提供。綿羊陽性血清和陰性血清分別來自于自然感染細粒棘球蚴的綿羊和非包蟲病流行區域的健康綿羊，二者通過尸體剖解確定。4只2.0～2.5 kg健康雄性新西蘭兔購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.4 生物信息學分析

通過NCBI數據庫獲得Eg-BAG3(登錄號：XM_024490124.1)和Eg-EB1(登錄號: CDS21096.1)基因的全長編碼序列并對其進行生物信息學分析。利用Expasy(http://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白基本理化性質，包括氨基酸數目、分子量和等電點；蛋白信號肽、跨膜區、亞細胞定位、結構域及二級結構分別利用SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)、TMHMM-2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)、WOLFPSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)、InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)和SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進行預測。此外，利用DNAMAN軟件和MEGA軟件(version 5.05)分別對Eg-BAG3、Eg-EB1及其同源基因進行多序列比對并采用鄰接法(Neighbor-joining, NJ)構建系統進化樹。

1.5 Eg-BAG3和Eg-EB1的克隆、表達與純化

利用動物組織RNA提取試劑盒提取原頭蚴總RNA并反轉錄為cDNA，參考數據庫中Eg-BAG3和Eg-EB1基因的全長編碼序列設計特異性引物，其中Eg-BAG3上游和下游引物分別是5′-CGCATGTCGGTGCCTCACGTT-3′(下劃線為H Ⅰ酶切位點)和5′-CCGCTAAGCATCGCTTTCCTTTG-3′(下劃線為R Ⅰ酶切位點)；Eg-EB1上游和下游引物分別是5′-CGCATGAATTACTTGTTCATCGTTTTC-3′(下劃線為H Ⅰ酶切位點)和5′-CCTACTCGCCCAGCATCATAC-3′(下劃線為Ⅰ酶切位點)，隨后利用提取的原頭蚴cDNA為模板進行PCR擴增，反應條件，95 ℃預變性4 min，95 ℃變性45 s，58 ℃退火1 min,72 ℃延伸45 s，35個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物經膠回收后克隆導入pMD19-T載體并轉入DH5α感受態細胞，挑取單個菌落，經PCR鑒定為陽性后提取質粒送上海生物工程有限公司測序。將構建成功的pMD19-T-Eg-BAG3及 pMD19-T-Eg-EB1質粒雙酶切回收后分別亞克隆入pET-28a(+)和pET-32a(+)載體中，隨后將構建成功的pET-28a(+)-Eg-BAG3和pET-32a(+)-Eg-EB1轉入大腸桿菌BL21(DE3)表達菌中，于37 ℃條件下加入IPTG誘導表達6 h，收集菌體并超聲破碎菌體，離心后收集上清液及沉淀，二者均進行SDS-PAGE以驗證重組蛋白的主要表達形式，隨后利用Ni親和層析柱純化上清或者沉淀中的表達產物，12% SDS-PAGE驗證蛋白表達及純化效果。

1.6 多克隆抗體制備

兔抗rEg-BAG3 IgG和兔抗rEg-EB1 IgG按照以下步驟制備：首次免疫時，將200 μg純化后的重組蛋白利用等體積的完全弗氏佐劑充分乳化，然后以皮下注射方式對4只新西蘭兔進行免疫，每種蛋白免疫2只。隨后利用不完全弗氏佐劑和重組蛋白連續加強免疫3次，每次間隔一周，最后一次免疫一周后采血分離血清，并利用HiTrap Protein A預裝柱純化獲得IgG。此外，免疫前對4只新西蘭兔進行采血獲得陰性血清。

1.7 免疫印跡

利用貝博總蛋白提取試劑盒提取原頭蚴總蛋白，制備12%SDS-PAGE電泳凝膠，對純化的rEg-BAG3、rEg-EB1、西氏貝蛔蟲重組硫氧還蛋白過氧化物酶(rBs-Tpx)及原頭蚴總蛋白進行電泳后轉至硝酸纖維素膜(NC膜)上，TBST洗膜3次(每次5 min)后加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，封閉完成后，加入綿羊陰性血清、綿羊陽性血清(1∶100稀釋)、兔陰性血清、兔抗rEg-BAG3 IgG或兔抗rEg-EB1 IgG(1∶400稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后加入HRP標記的兔抗綿羊IgG(1∶1 000稀釋)或山羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h，然后根據Metal Enhanced DAB Substrate Kit(20×)說明加入顯色液避光顯色至條帶出現，加入雙蒸水終止反應。

1.8 免疫熒光定位

原頭蚴、育囊、不育囊及45日齡成蟲在4%多聚甲醛中固定24 h后，制成石蠟切片(5 μm)，切片進行脫蠟復水后在0.01 mol·L枸櫞酸緩沖液中95 ℃加熱20 min進行抗原修復，隨后在組織上滴加5%山羊血清并于37 ℃孵育1 h，對組織上的非特性位點進行封閉。在組織上滴加兔陰性血清、兔抗rEg-BAG3 IgG或兔抗rEg-EB1 IgG(1∶400稀釋)，于4 ℃孵育過夜。第二天經PBS清洗3次后加入FITC conjugated goat anti-rabbit IgG(H+L)(1∶2 000稀釋)避光孵育1 h，PBS清洗3次后加入DAPI染液染色3～5 min，再次清洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片，并利用熒光顯微鏡采集圖像并拍照。

1.9 H2O2誘導原頭蚴細胞凋亡及Eg-BAG3、Eg-EB1轉錄水平的變化

將新鮮采集的原頭蚴利用無菌PBS清洗3次后，利用0.4%臺盼藍染液進行染色，確保原頭蚴存活率大于95%。隨后，將原頭蚴加入含10%胎牛血清、100 U·mL青霉素、100 μg·mL硫酸鏈霉素的RPMI1640培養基中重懸計數，調整數目為約3 000個·mL,按照每孔3 mL原頭蚴懸液接種于6孔細胞培養板并置于37 ℃、5% CO的培養箱中培養24 h。原頭蚴分為處理組(T group)和空白組(NC group)，每組3個重復，24 h后處理組加入10 mmol·LHO處理8 h，對照組加入等體積PBS,以處理前作為0 h, 分別于處理后2、4、6及8 h收集原頭蚴并通過光學顯微鏡和透射電子顯微鏡對原頭蚴形態及超微結構進行觀察，同時，利用qRT-PCR對Eg-BAG3和Eg-EB1的轉錄水平進行分析，以(NCBI登錄號：XM_024497550.1)為內參基因，設計引物：Eg-BAG3上下游引物：5′-AGATGGTCAGGACAGCGTTC-3′和5′-GAGGTGTCTTCAACCGCATT-3′；Eg-EB1上下游引物：5′-GTATGGCCACTGCCAGAAAG-3′和5′-CTCCTCCAGCTTGGTCTTTG-3′；上下游引物: 5′-ATGGTTGGTATGGGACAAAAGG-3′和5′-TTCGTCACAATACCGTGCTC-3′。反應程序:95 ℃預變性30 s；兩步法擴增95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，40個循環；熔解95 ℃ 5 s，56 ℃ 60 s，95 ℃ 1 s，反應結束后結果采用2-ΔΔC法分析。

1.10 原頭蚴Eg-BAG3和Eg-EB1基因RNA干擾分析

為了進一步探究Eg-BAG3和Eg-EB1在調控HO誘導的原頭蚴細胞凋亡中可能起到的作用，本研究首先通過siRNA轉染原頭蚴的方式抑制Eg-BAG3和Eg-EB1在原頭蚴中的表達水平。根據Eg-BAG3和Eg-EB1基因序列，利用在線軟件siRNA Target Finder針對兩個基因序列的3個不同區域，分別設計出3對特異性的siRNA，同時設計1對與細粒棘球絳蟲任何基因均無關的siRNA作為陰性對照。此外，每段引物的3′末端均添加TT以增強siRNA的穩定性，陰性對照siRNA的5′末端還添加FAM熒光標記，用于檢測siRNA的轉染效率，具體序列如表1所示。將原頭蚴分為8個組，分別是6個不同siRNA試驗組、陰性對照組(siRNA-CON)以及空白對照組(不做任何處理)，每組3個重復孔，每孔3 mL培養基，約含原頭蚴4 000個。向500 pmol siRNA中加入25 μL RPMI1640培養基，制成siRNA稀釋液，然后取10 μL轉染試劑Entranster-R4000加入15 μL RPMI1640培養基，充分混勻，制成終體積為25 μL的轉染試劑稀釋液，將25 μL轉染試劑稀釋液和25 μL siRNA稀釋液充分混勻后全部加入到含有2.45 mL完全培養基的原頭蚴中，放于37 ℃、5% CO培養箱中培養24 h，隨后更換新的培養液按照上述步驟再次進行轉染，24 h后在熒光顯微鏡下隨機選取不同視野，分別計數其中帶有和不帶有熒光標記的原頭蚴估算轉染效率。離心收集蟲體，提取蟲體總RNA并合成cDNA，利用qRT-PCR對Eg-BAG3和Eg-EB1的轉錄水平進行分析從而篩選出干擾效率最高的siRNA。

表1 siRNAs序列

將干擾效率最高的siRNA處理后的原頭蚴(BAG3-IG及EB1-IG)、未干擾組(NIG)原頭蚴(僅轉染siRNA-CON)利用10 mmol·LHO于37 ℃、5% CO的培養箱中作用8 h，空白對照組(NCG)原頭蚴既不經siRNA處理，也不經HO處理，同樣于37 ℃、5% CO的培養箱中培養8 h，隨后收集所有組的原頭蚴并制作石蠟切片(4 μm)。根據dUTP缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling, TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒的說明對組織進行標記，并加入DAPI染液作用3～5 min對細胞核進行染色，PBS清洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。隨后在熒光顯微鏡下隨機選取400倍鏡下的3個視野對切片進行拍照，并應用Image-Pro Plus 6.0軟件對細胞進行計數分析。其中綠色熒光細胞被判定為陽性細胞，藍色熒光為DAPI染色后的細胞核，將每張照片的陽性細胞數和總細胞數進行計數后，按照陽性細胞數/總細胞數×100%計算出原頭蚴細胞凋亡率。

1.11 統計學分析

2 結 果

2.1 Eg-BAG3 和Eg-EB1的擴增與生物信息學分析

Eg-BAG3 和Eg-EB1基因編碼序列全長分別為699和759 bp，無信號肽和跨膜區且主要分布于細胞質中。結構域預測顯示Eg-BAG3有1個位于N端的WW結構域(aa 7―41)和1個位于C端的BAG結構域(aa 125―202)，Eg-EB1有1個 BAR(Bin/Amphiphysin/Rvs，BAR)結構域(aa 19―252)。二級結構預測顯示Eg-BAG3主要是無規則卷曲，其次是α螺旋和β折疊(圖1a)，Eg-EB1二級結構則以α螺旋為主，無規則卷曲和β折疊則較少(圖1b)。通過與其他物種BAG3和EB1的氨基酸序列進行比對分析，結果顯示，Eg-BAG3 在不同物種之間具有較高的變異性，僅與多房棘球絳蟲()BAG3的相似性最高(95.69%)，而與其他絳蟲如微口膜殼絳蟲()BAG3的相似性較低，僅為49.16%，與日本血吸蟲()和曼氏血吸蟲()BAG3的相似性則更低，均小于30%(圖1a)。Eg-EB1在物種之間的保守性較高，尤其是絳蟲，Eg-EB1與多房棘球絳蟲()、亞洲帶絳蟲()、牛帶絳蟲()、豬帶絳蟲()EB1的相似性均高達70%以上，而與吸蟲EB1的相似性相對較低(圖1b)。進化樹結果顯示，Eg-BAG3和Eg-EB1均與多房棘球絳蟲()、亞洲帶絳蟲()、微口膜殼絳蟲()的BAG3或EB1屬于同一分支，具有較近的親緣關系，而與其他吸蟲、線蟲或哺乳動物的BAG3或EB1親緣關系較遠(圖2)。

GenBank accession numbers：Echinococcus granulosus BAG3(CDS17299.1); Echinococcus multilocularis BAG3(CDS42338.1); Hymenolepis microstoma BAG3(CDS26401.1); Schistosoma mansoni BAG3(XP_018645045.1); Schistosoma japonicum BAG3(AAP06461.1); Echinococcus granulosus EB1(CDS21096.1); Echinococcus multilocularis EB1(CDS38179.1); Taenia asiatica EB1(ANC29539.1); Taenia saginata EB1(ANC29539.1); Taenia solium EB1(AEF14021.1); Hymenolepis microstoma EB1(CDS27698.1); Schistosoma mansoni EB1(XP_018647699.1); Schistosoma japonicum EB1(CAX70483.1); Clonorchis sinensis EB1(GAA56152.1)

圖2 Eg-BAG3(a)和Eg-EB1(b)系統進化樹

2.2 rEg-BAG3和rEg-EB1的表達、純化及免疫印跡

rEg-BAG3和rEg-EB1均成功表達于BL21(DE3)中，蛋白分子大小分別約為 30 ku(圖3a)和46 ku(圖3b)，大小與預期相符且二者都以上清形式存在。免疫印跡結果顯示，rEg-BAG3和rEg-EB1都可以被自然感染細粒棘球蚴綿羊的陽性血清特異性識別，而與健康綿羊陰性血清不反應，說明Eg-BAG3和Eg-EB1都具有較好的免疫反應性；兔抗rEg-BAG3 IgG和兔抗rEg-EB1 IgG分別可以特異性識別rEg-BAG3和 rEg-EB1，但無法識別rBs-Tpx，說明兔抗rEg-BAG3 IgG和rEg-EB1 IgG僅可以和rEg-BAG3及rEg-EB1特異性結合，而與其他蛋白不反應。此外，兔抗rEg-BAG3 IgG和兔抗rEg-EB1 IgG在原頭蚴總蛋白中特異性識別出天然蛋白Eg-BAG3和Eg-EB1，大小分別約為26和29 ku(圖3)，表明Eg-BAG3和Eg-EB1表達于原頭蚴中且可能參與調控原頭蚴的生長發育過程。

表2 Eg-BAG3 和Eg-EB1基本分子特征分析

M.蛋白質相對分子質量標準品；1.IPTG誘導后rEg-BAG3/rEg-EB1的表達；2.純化后的rEg-BAG3/rEg-EB1；3.兔抗rEg-BAG3 IgG/rEg-EB1 IgG識別rEg-BAG3/rEg-EB1；4.兔陰性血清識別rEg-BAG3/rEg-EB1；5.兔抗rEg-BAG3 IgG/兔抗rEg-EB1 IgG識別rBs-Tpx；6.自然感染細粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別rEg-BAG3/rEg-EB1；7.健康綿羊陰性血清識別rEg-BAG3/rEg-EB1；8.兔抗rEg-BAG3 IgG/rEg-EB1 IgG識別原頭蚴粗蛋白

2.3 免疫熒光定位

Eg-BAG3和Eg-EB1在原頭蚴、成蟲、育囊與不育囊的免疫熒光定位分析顯示Eg-BAG3在細粒棘球絳蟲各個發育時期均有分布，且主要分布于生發層以及原頭蚴和成蟲的皮層和實質組織(圖4a)。Eg-EB1主要分布于原頭蚴的皮層、頂突和吸盤以及包囊生發層，但在成蟲未見特異性分布(圖4b)。

LL.角質層；GL.生發層；Teg.皮層；PR.實質組織；S.吸盤；R.頂突。標尺：50 μm

2.4 H2O2誘導原頭蚴細胞凋亡及Eg-BAG3、Eg-EB1轉錄水平的變化

在利用10 mmol·LHO連續作用原頭蚴8 h后，原頭蚴形態及超微結構均出現明顯的凋亡相關的變化，光學顯微鏡下HO處理組原頭蚴頭節出現腫脹、塌陷甚至破裂的現象，原頭蚴體積縮小、鈣顆粒變小或模糊不清(圖5 d)，而空白組原頭蚴結構仍舊清晰、完整，鈣顆粒清亮而明顯(圖5a)。透射電鏡結果顯示HO處理組原頭蚴細胞呈現典型的凋亡相關變化，如胞體變小、皺縮，染色質凝集，甚至出現細胞核破裂等變化(圖5e、f)，而空白組原頭蚴細胞核結構正常(圖5b、c)。qRT-PCR結果顯示，處理組原頭蚴Eg-BAG3的相對轉錄水平隨著HO處理時間的延長而逐漸上升，在6和8 h的相對轉錄水平與0 h相比，差異顯著(<0.05)(圖6a)。Eg-EB1的相對轉錄水平也隨著HO處理時間的延長而逐漸上升，在8 h的相對轉錄水平與0 h相比統計學差異顯著(<0.05)(圖6b)。空白組原頭蚴在0～8 h的Eg-BAG3和Eg-EB1相對轉錄水平均無顯著差異(>0.05)。綜上，提示Eg-BAG3和Eg-EB1可能均參與調控HO誘導的原頭蚴細胞凋亡。

a.光學顯微鏡下的空白組原頭蚴(10×)；b、c.透射電鏡下的空白組原頭蚴；d.光學顯微鏡下的H2O2處理組原頭蚴(10×)；e、f.透射電鏡下的H2O2處理組原頭蚴。箭頭代表原頭蚴細胞凋亡的典型變化

數據為三次試驗的每組0 h和其他時間點之間的統計學上的顯著差異用One-way ANOVA分析來確定(*.P<0.05)

2.5 原頭蚴Eg-BAG3和Eg-EB1 RNA干擾分析

為了進一步探究Eg-BAG3和Eg-EB1在HO誘導的原頭蚴細胞凋亡中起到的具體作用，本研究分別以3對針對Eg-BAG3或Eg-EB1不同位點區域的siRNA以及無關siRNA通過浸染法轉染原頭蚴，通過siRNA上帶有的FAM熒光標記在熒光顯微鏡下估算轉染效率約為60%，說明成功將siRNA導入了原頭蚴體內。qRT-PCR結果顯示，針對Eg-BAG3的3對siRNA干擾組原頭蚴(BAG-108、BAG-181和BAG-486)的Eg-BAG3相對轉錄水平均降低，分別為siRNA-CON組原頭蚴的52.24%、32.68%和57.57%；針對Eg-EB1的3對siRNA干擾組原頭蚴(EB-91、EB-360和EB-476)的Eg-EB1的相對轉錄水平也都降低，分別為siRNA-CON組原頭蚴的39.87%、66.59%和64.62%，表明BAG-181和EB-91的干擾效率最高。通過進一步利用HO處理干擾效率最高的siRNA轉染后的原頭蚴,并應用TUNEL法對原頭蚴細胞的凋亡情況進行檢測，結果顯示Eg-BAG3干擾組原頭蚴細胞凋亡率(72.68%±10.00%)顯著高于未干擾組(63.87%±6.10%)，<0.05，而Eg-EB1干擾組原頭蚴細胞凋亡率(50.43%±9.14%)低于未干擾組(63.87%±6.10%)，<0.05(表3，圖7)。值得注意的是，未干擾組原頭蚴的總細胞數相對于空白組及Eg-BAG3和Eg-EB1干擾組較少，可能是由于蟲體在制作石蠟切片時，各組蟲體不同切面的細胞數不同引起的。

表3 TUNEL法測定原頭蚴細胞凋亡率

a.空白組原頭蚴；b.未干擾組原頭蚴；c.Eg-BAG3干擾組原頭蚴；d.Eg-EB1干擾組原頭蚴

3 討 論

BAG3屬于BAG蛋白家族，該蛋白家族成員的基本特征是在C末端存在保守的 BAG 結構域且該結構域可形成3個平行的短α螺旋結構，此外，某些BAG蛋白還有WW結構域、富含脯氨酸的PXXP結構域、核定位信號(nuclear localization signal，NLS)、泛素樣(ubiquitin-like，UBL)結構域，其中WW結構域僅見于BAG3蛋白。Eg-BAG3含有1個BAG結構域和1個WW結構域，且BAG結構域形成3個明顯的短α螺旋結構，表明Eg-BAG3具有BAG蛋白家族的基本結構特征。BAG蛋白正是通過這些結構域與細胞內各種信號分子蛋白相互作用，從而參與調控各種生理活動，目前,已被研究證實BAG蛋白可以通過BAG結構域和HSP70的ATP酶結構域結合從而作為HSP70的共分子伴侶調節多種生理活動，如細胞凋亡、自噬、遷移、黏附等。內吞蛋白B1由位于N端的BAR結構域，中間的可變區以及C端的SH3(SRC homology-3)結構域構成，其中，BAR結構域具有綁定磷脂雙分子層并使膜彎曲的特性，參與囊泡的形成；SH3結構域可以結合多種內吞蛋白，在細胞內吞方面起到重要的調控作用。從結構域預測分析結果來看，Eg-EB1含典型的BAR結構域,但缺少SH3結構域，具體原因目前尚不清楚。免疫熒光定位顯示，Eg-BAG3廣泛分布于細粒棘球絳蟲的各個發育時期，包括原頭蚴、成蟲以及包囊生發層，提示Eg-BAG3可能在蟲體的整個生長發育過程中均扮演重要角色。Eg-EB1在細粒棘球絳蟲中曾被鑒定為一個大小約為29 ku的抗原分子(P-29)，且主要定位于原頭蚴的皮層和頂突以及包囊生發層，但在包囊液或成蟲提取物中不存在。同樣，Eg-EB1在本研究也被發現主要定位于原頭蚴皮層、頂突以及包囊生發層，而在成蟲則未見分布，推測Eg-EB1可能主要參與調節細粒棘球絳蟲幼蟲階段的生長發育。

細粒棘球蚴包囊可以在中間宿主體內長期存在并產生大量原頭蚴，在此過程中宿主調動自身的免疫系統，通過各種免疫細胞的直接或者間接作用攻擊蟲體，其中，宿主免疫細胞產生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)是一個重要的可以有效誘導原頭蚴細胞凋亡的物質。ROS包括過氧化氫(HO)、超氧陰離子自由基(O)、羥基自由基(-OH)等代謝產物，高濃度的ROS將嚴重損傷細胞DNA、蛋白質及脂質，從而引起細胞凋亡，目前，HO已被用于誘導多房棘球絳蟲和細粒棘球絳蟲的細胞凋亡。有研究報道顯示，BAG3具有抑制細胞凋亡的作用，當細胞受到活性氧等多種外界因素刺激時，BAG3將被激活，表達量顯著上升，細胞凋亡被抑制，而當BAG3的表達受到抑制時，細胞凋亡將增加；在人骨肉瘤細胞和黑色素瘤細胞中，BAG3可以阻止IKK-γ進入蛋白酶體依賴的蛋白降解途徑，維持NF-κB的持續激活從而促進細胞存活；在人膠質母細胞瘤細胞中，BAG3可以將BAX蛋白保留在細胞質中，阻止其在線粒體外膜上形成孔道，起到抑制細胞凋亡的作用；在人髓系U937細胞中，BAG3蛋白表達水平的下調將顯著促進DEM誘導的細胞凋亡。本研究中，HO被用于誘導原頭蚴細胞凋亡，HO處理后原頭蚴體內Eg-BAG3的相對轉錄水平隨著HO處理時間的延長顯著上調，且在利用siRNA抑制Eg-BAG3表達水平后，原頭蚴細胞凋亡率相對于未干擾組原頭蚴而言顯著上調，這表明抑制Eg-BAG3基因的表達將會促進原頭蚴細胞凋亡，即Eg-BAG3具有抗凋亡作用。EB1蛋白作為Bax蛋白的激活因子，研究發現其可能具有促凋亡作用，如在HeLa 細胞中過表達EB1能夠促進細胞凋亡，而下調EB1的表達則可以抑制細胞色素C的釋放從而抑制細胞凋亡；在前列腺癌細胞中過表達EB1可以顯著抑制細胞增殖，促進癌細胞凋亡。在本研究中Eg-EB1的相對轉錄水平隨著HO處理時間的延長而顯著上調，且在利用siRNA抑制Eg-EB1表達水平后，原頭蚴細胞凋亡率相對于未干擾組原頭蚴而言顯著降低，意味著抑制Eg-EB1的表達將會抑制原頭蚴細胞凋亡，即Eg-EB1具有促凋亡作用。

不育囊的產生是細粒棘球蚴存在的一種獨特的生物學現象，目前研究發現不育囊的形成是多種因素共同作用下的結果，包括宿主的種類、年齡、生活環境、包囊在宿主體內的寄生部位、基因型及宿主免疫反應等，此外也有研究報道細胞凋亡可能與不育囊形成之間有著密切聯系。研究人員通過TUNEL分析和瓊脂糖凝膠電泳發現不育囊生發層中的DNA片段化水平顯著高于可育囊，且不育囊生發層中caspase 3的酶活性也高于可育囊，提示細胞凋亡可能是誘導不育囊形成的原因之一；此外，相比于可育囊生發層而言，不育囊生發層表現出更嚴重的DNA氧化損傷，而且不育囊生發層中凋亡相關配體如TNF相關的凋亡誘導配體(TRAIL)及Fas-L的表達水平顯著高于可育囊。鑒于細胞凋亡與細粒棘球蚴不育囊形成之間的密切聯系，且原頭蚴細胞來源于生發層細胞，Eg-BAG3和Eg-EB1分別對原頭蚴細胞凋亡起著抑制和促進作用，因此Eg-BAG3和Eg-EB1也可能參與調控生發層細胞的凋亡，從而進一步調控不育囊的形成。

4 結 論

Eg-BAG3和Eg-EB1分別屬于典型的BAG蛋白和內吞蛋白。Eg-BAG3廣泛分布于蟲體的各個發育階段，而Eg-EB1僅分布于原頭蚴和包囊生發層，成蟲無分布，提示二者可能在細粒棘球絳蟲生長發育過程中起不同的作用。Eg-BAG3和Eg-EB1在HO誘導原頭蚴細胞凋亡的過程中轉錄水平顯著上調，當二者表達被抑制后，Eg-BAG3干擾組原頭蚴細胞凋亡率明顯上升，而Eg-EB1干擾組原頭蚴細胞凋亡率下降，表明Eg-BAG3和Eg-EB1在HO誘導的原頭蚴細胞凋亡過程中分別起著抗凋亡和促凋亡作用，且二者可能進一步參與調控不育囊的形成。