人氨基肽酶N在豬丁型冠狀病毒感染HEK293細胞中的作用

趙玉佳，陳 汭，宋代麗，張路文，肖 黛，李施倩，文翼平，伍 銳，趙 勤，杜森焱，顏其貴，文心田，曹三杰,2,3，黃小波,2,3*

(1.四川農業大學動物醫學院豬病研究中心，成都 611130；2.農業農村部獸用藥物與獸醫診斷技術四川科學觀測實驗站，成都 611130；3.四川農業大學國家級動物類實驗教學示范中心，成都 611130)

丁型冠狀病毒(deltacoronavirus)是新發現的冠狀病毒科()，丁型冠狀病毒屬()成員，可以感染哺乳動物和禽類。2009年，Woo等發現3種禽丁型冠狀病毒：夜鶯冠狀病毒HKU11、畫眉冠狀病毒HKU12和文鳥冠狀病毒HKU13。2012年，Woo等在豬和鳥群中鑒定出7種新型丁型冠狀病毒，對豬冠狀病毒HKU15-44和HKU15-155毒株13、和基因序列分析顯示其與亞洲豹貓冠狀病毒相似性高達99.8%，說明PDCoV在野生小型哺乳動物和豬之間可能存在跨種傳播。2014年，美國暴發豬丁型冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)感染。隨后，韓國、加拿大、泰國、越南、日本和中國等國家也報道PDCoV引起的仔豬腹瀉性疾病。當前，已報道的PDCoV毒株全基因組序列相對保守，序列分析表明，PDCoV可能起源于麻雀丁型冠狀病毒(sparrow deltacoronavirus，SpCoV)。此外，美國報道的4種新型SpCoV與PDCoV親緣關系更為密切，表明PDCoV在豬和禽類之間也可能發生跨種傳播。

PDCoV是引起豬腸道疾病的主要病原，可感染各年齡階段的豬，感染仔豬出現嘔吐、腹瀉、脫水和死亡等臨床癥狀，影響全球養豬業的健康發展。人工接種PDCoV還可感染牛、雞和火雞等多種動物。體外試驗證實，病毒也可感染豬源細胞(LLC-PK、PK15、ST、IPEC和IPI-2I)、人源細胞(Huh7和Hela)、禽源細胞(LMH和DF-1)、牛源細胞(PBK和PBH)、猴源細胞(Vero-CCL81)和犬源細胞(MDCK)等多種細胞，顯示PDCoV具有廣泛的跨宿主傳播風險。

氨基肽酶N(aminopeptidase N，APN)，又稱CD13，是一種膜結合的金屬蛋白酶，可與冠狀病毒S蛋白結合，介導病毒入侵宿主細胞。甲型冠狀病毒中，傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、貓冠狀病毒(feline coronavirus，FCoV)、犬冠狀病毒(canine coronavirus，CCoV)和人冠狀病毒229E(human coronavirus 229E，HCoV-229E)被鑒定出以APN作為功能受體。此外，APN作為冠狀病毒受體具有種屬特異性。有研究表明，HCoV-229E以hAPN作為受體，而不能以豬APN(porcine APN，pAPN)作為受體。貓APN(feline APN，fAPN)可與TGEV、CCoV、HCoV-229E和FCoV結合。但是，APN在PDCoV入侵宿主細胞的過程中是否發揮受體功能存在爭議。Li等構建APN基因敲除細胞證明APN是PDCoV感染多種動物細胞的功能受體，病毒可通過S蛋白的S1結構域與APN的催化區域發生互作。Wang等也證明，pAPN在PDCoV入侵細胞中發揮受體功能。與之相反，部分研究結果卻證明，APN不是PDCoV的受體。也有研究顯示，APN雖不是PDCoV的關鍵受體，但其能影響PDCoV的早期感染和增殖過程。另外，Stoian等卻認為APN是PDCoV感染細胞的一個非必需細胞受體。

為驗證hAPN在PDCoV復制中的作用，本研究首先證實PDCoV可感染HEK293細胞，再進一步構建hAPN基因敲除細胞系和hAPN過表達質粒，驗證hAPN在PDCoV復制中的作用。通過同源建模和分子對接模擬PDCoV S 蛋白與hAPN蛋白的相互作用，為闡述PDCoV的細胞入侵機制和跨種傳播提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒和主要試劑

HEK293、HEK293T和ST細胞由本實驗室凍存；PDCoV四川分離株CHN-SC2015(GenBank收錄號：MK355396.1)由本實驗室分離、鑒定和保存。pCMV-SPORT6-ANPEP質粒由本實驗室構建保存；兔抗ACTB多克隆抗體(AC026)，HRP-羊抗兔IgG(AS014)，HRP-羊抗鼠IgG(AS003)：武漢Abclonal公司；鼠抗ANPEP單克隆抗體(sc-166105)：Santa Cruz公司；兔抗PDCoV N多克隆抗體由本實驗室制備保存。

1.2 PDCoV感染HEK293細胞

將PDCoV以MOI=0.1接種60 mm培養皿中的HEK293細胞，37 ℃吸附1 h，PBS洗2遍，加維持液繼續培養。于0、12、24、36和48 h取樣，通過RT-qPCR和Western blot檢測PDCoV感染HEK293細胞后的病毒含量；將PDCoV感染HEK293細胞24 h后的細胞培養物凍融3次后，連續傳至4代，通過RT-PCR檢測PDCoV在HEK293細胞上的增殖情況，TCID檢測不同代次的病毒滴度。

1.3 hAPN基因敲除細胞系的構建與鑒定

參考hAPN基因(NC_000015)序列，利用網絡在線工具(http://chopchop.cbu.uib.no/)設計一對sgRNA(表1)。合成的sgRNA經退火處理，連接到B Ⅰ酶切的線性化載體lenti CRISPR v2，構建同時表達Cas9和sgRNA的慢病毒轉移質粒。用Lipofectamine 3000將質粒按重組質粒∶psPAX2∶pMD2.G=5∶3∶2的比例共轉染至HEK293T細胞中，48 h后收上清。待T25細胞瓶中HEK293細胞長至50%時，感染慢病毒，36 h后，用含1 μg·mL嘌呤霉素(puromycin)的完全培養基進行抗性篩選；有限稀釋法挑選hAPN基因敲除細胞系，將其命名為hAPN。通過測序、RT-qPCR和Western blot鑒定hAPN在HEK293細胞上的敲除情況。

表1 相關引物序列

1.4 細胞活性鑒定

按照10·孔的細胞數將野生型細胞(hAPN)和敲除細胞(hAPN)接種96孔細胞板，24 h后，避光條件下，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h，測定450 nm的吸光度。計算細胞存活率，細胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，As：試驗孔(hAPN細胞孔)；Ac：對照孔(hAPN細胞孔)；Ab：空白孔(培養基)。

1.5 敲除hAPN對PDCoV復制的影響

待60 mm細胞培養皿中hAPN和hAPN長滿單層后，PBS洗2遍，將PDCoV以MOI=0.1的劑量感染細胞，37 ℃孵育1 h，棄病毒液，每孔加入4 mL維持液，于24 h收集細胞懸液和蛋白，細胞懸液用RT-qPCR檢測基因轉錄水平；蛋白樣品用Western blot檢測N蛋白表達水平。

1.6 過表達hAPN對PDCoV復制的影響

針對hAPN基因的CDs區設計引物，經PCR擴增后連接到載體pIRES2-EGFP，構建hAPN過表達真核載體(命名為pIRES2-EGFP-hAPN)。待HEK293細胞長至50%時，用Lipofectamine 3000分別轉染4 μg質粒pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-hAPN至HEK293細胞；轉染24 h后，觀察綠色熒光蛋白表達情況；收集細胞和細胞蛋白，分別用RT-qPCR和Western blot檢測hAPN表達。以MOI為0.1的PDCoV感染轉染pIRES2-EGFP-hAPN的HEK293細胞，同時設轉染pIRES2-EGFP空載的HEK293細胞為對照，24 h后，收集細胞懸液和蛋白，細胞懸液通過RT-qPCR檢測基因轉錄水平；蛋白樣品通過Western blot檢測N蛋白表達水平。

1.7 同源建模與分子對接

hAPN蛋白(PDB ID：4FYQ)、PDCoV S蛋白(PDB ID：6B7 N)和HCoV-229E S(PDB ID：6U7H)的整體結構從蛋白質數據庫獲取(https://www.rcsb.org)。用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)手動構建PDCoV S蛋白和HCoV-229E S蛋白的單體結構和受體結構域(receptor binding domain，RBD)，用PyMOL對hAPN、PDCoV S和HCoV-229E S蛋白的三維結構進行可視化分析；用MEGA6、ESPrit 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php)和PyMOL的align功能對PDCoV和HCoV-229E S蛋白的RBD進行序列和結構比對。用分子對接方法模擬PDCoV S1蛋白與hAPN蛋白的相互作用。

1.8 TCID50測定

取100 μL病毒液，按照10倍梯度進行倍比稀釋，共稀釋7個梯度，每個稀釋度設置8個重復，同時設置空白對照。待96孔細胞板中的ST細胞長滿單層后，PBS洗2遍，加入100 μL稀釋好的病毒液，37 ℃孵育1.5 h，棄病毒液，加入150 μL含5 μg·mL胰酶的維持液，37 ℃繼續培養。每日觀察細胞病變，連續觀察4 d，按照Reed&Muench方法計算TCID。

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 PDCoV在HEK293細胞中的增殖情況

將PDCoV以MOI=0.1感染HEK293細胞，收取0、12、24、36和48 h的樣品，RT-qPCR檢測病毒含量。結果發現，病毒感染細胞12～36 h時，病毒快速增殖，36 h達到頂峰；36～48 h，出現下降趨勢(圖1A)；此外，在0～24 h，病毒N蛋白表達水平也迅速增加(圖1C)。將PDCoV在HEK293細胞上連續傳至4代，RT-PCR檢測發現當傳至第3代時，只能檢測到很弱的條帶，而傳至第4代時，檢測不到條帶(圖1B)；Western blot 檢測發現，PDCoV傳至2代時，仍可檢測到很弱的病毒N蛋白表達水平(圖1D)；TCID結果表明，PDCoV在HEK293細胞上第1代滴度約為4.36 lg TCID·mL，傳至2代時，病毒滴度稍微下降，約為3 lg TCID·mL(圖1E)，表明PDCoV可感染HEK293細胞，但是不能在HEK293細胞上穩定傳代。

A.RT-qPCR檢測PDCoV在HEK293細胞上的增殖情況；B.RT-PCR檢測PDCoV在HEK293細胞上的傳代；C.Western blot檢測PDCoV感染細胞不同時間點的N蛋白表達水平；D.Western blot檢測PDCoV感染HEK293細胞不同代次的N蛋白表達水平；E.TCID50檢測PDCoV感染HEK293細胞不同代次的病毒滴度

2.2 hAPN基因敲除細胞系的構建和鑒定

用CRISPR/Cas9技術構建hAPN基因敲除細胞系，通過測序、RT-qPCR和Western blot檢測hAPN在HEK293細胞上的敲除情況。測序結果顯示，hAPN細胞系在PAM序列前出現明顯的重疊峰，且存在23個堿基的連續缺失(圖2A)；RT-qPCR和Western blot結果顯示，在hAPN細胞上幾乎檢測不到hAPN基因表達(圖2B、C)，表明hAPN在HEK293細胞上缺失成功。細胞活性檢測發現，hAPN和hAPN的活性無差異(圖2D)，表明敲除hAPN對HEK293細胞活性無影響。

A.hAPNWT和hAPNKO細胞中hAPN基因的序列測定；B.RT-qPCR檢測hAPNKO細胞的hAPN基因mRNA水平(***.P<0.001)；C.Western blot檢測hAPNKO細胞的hAPN蛋白表達水平；D.CCK-8檢測hAPNWT和hAPNKO細胞的細胞活性(ns.P>0.05)

2.3 敲除hAPN可降低PDCoV復制

為驗證hAPN敲除對PDCoV復制的影響，將PDCoV以MOI=0.1感染hAPN和hAPN細胞，24 h后，測定基因轉錄水平和N蛋白表達水平。結果表明，hAPN基因敲除后，導致基因mRNA水平下調約75%(圖3 A)，N蛋白表達水平下降約66%(圖3 B)，證實hAPN敲除能夠顯著抑制PDCoV復制。

A.RT-qPCR檢測敲除hAPN后PDCoV M基因mRNA水平(***.P<0.001)；B.Western blot檢測敲除hAPN后PDCoV N蛋白表達水平

2.4 過表達hAPN可促進PDCoV復制

為進一步驗證hPAN過表達對PDCoV復制的影響，構建hAPN真核表達質粒pIRES2-EGFP-hAPN，轉染至HEK293細胞中，24 h后，可以觀察到明顯的綠色熒光(圖4 A)。RT-qPCR和Western blot檢測發現，hAPN在HEK293細胞中成功表達(圖4 B、C)。將pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-hAPN分別轉染HEK293細胞24 h后，接種PDCoV，病毒感染24 h后，RT-qPCR和Western blot檢測表明，過表達hAPN導致M基因mRNA水平上調2.7倍，N蛋白表達水平上調1.7倍(圖4 D、E)，表明過表達hAPN促進PDCoV復制。

A.熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(標尺=100 μm)；B.RT-qPCR檢測HEK293細胞轉染pIRES2-EGFP-hAPN后hAPN基因mRNA水平(***.P<0.001)；C.Western blot檢測HEK293細胞轉染pIRES2-EGFP-hAPN后hAPN蛋白表達水平；D.RT-qPCR檢測過表達hAPN后M基因mRNA水平(***.P<0.001)；E.Western blot檢測過表達hAPN后N蛋白表達水平。掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖

2.5 hAPN與PDCoV S蛋白的互作分析

為分析hAPN和PDCoV S蛋白的互作關系，從PDB數據庫獲取hAPN和PDCoV S的三聚體結構(圖5 A、G)；PDCoV S蛋白的單體結構及其主要結構域包括C-末端結構域(C-terminal domain，CTD)、N-末端結構域(N-terminal domain，NTD)、融合肽(fusion peptide，FP)、七肽重復序列(heptad repeat，HR)(圖5 B)。HCoV-229E和PDCoV S1 RBD，包含6個β-折疊和3個短而不連續的環組成的受體結合基序(receptor binding motifs，RBM)(圖5 C、D)。序列和結構比對發現PDCoV和HCoV-229E S1 RBD具有相似的空間結構，表明PDCoV RBD與hAPN的結合可能類似HCoV-229E RBD和hAPN的結合(圖5 E、F)。分子對接結果表明，PDCoV S1 RBD能夠結合hAPN結構域Ⅱ，主要是S1蛋白的RBM1氨基酸殘基TYR、THR、THR、PHE和MET通過氫鍵與hAPN的氨基酸殘基PHE、GLN、ARG和SER結合(圖5 G、H)。

A.PDCoV S 蛋白整體結構；B.PDCoV S 蛋白單體結構；C.HCoV-229E S1 RBD；D.PDCoV S1 RBD；E.HCoV-229E和PDCoV S1 RBD結構比對；F.HCoV-229E和PDCoV S1 RBD序列比對；G～H.分子對接模擬PDCoV S1 RBD和hAPN蛋白的互作。掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖

3 討 論

PDCoV是近年來新發現的一種豬冠狀病毒，人工接種PDCoV能夠感染豬、牛、雞和火雞等多種動物。PDCoV感染仔豬后引起明顯的腹瀉癥狀，而感染小雞后腹瀉癥狀較輕，接種PDCoV的小牛甚至未出現腹瀉和其他臨床癥狀。Lednicky等在兒童血清樣品中檢測到變異的PDCoV，首次報道了PDCoV可感染人。鑒于PDCoV在豬群的廣泛流行和跨宿主傳播風險，研究宿主細胞蛋白在PDCoV復制中的作用具有重要意義。過表達hAPN、fAPN、pAPN、cAPN顯著增加細胞對PDCoV的易感性。APN在不同腸段中的差異表達與PDCoV腸道組織嗜性也密切相關。本研究發現敲除hAPN降低PDCoV復制，而過表達hAPN促進PDCoV復制，表明hAPN是影響PDCoV復制的重要宿主細胞因子，豐富了PDCoV跨種傳播和致病機制理論。

S蛋白是冠狀病毒入侵宿主細胞的關鍵蛋白，在病毒感染宿主細胞的過程中，S蛋白構象的變化能促進病毒囊膜與宿主細胞膜的融合。此外，宿主細胞內的酸性環境和蛋白水解酶對S蛋白的活化也是病毒囊膜與宿主細胞膜融合所必需的。胰蛋白酶可通過增強細胞與細胞之間的融合而促進PDCoV增殖，但在病毒入侵細胞的過程中不發揮關鍵作用。此外，PDCoV通過胰蛋白酶介導的細胞膜表面入侵ST和IPI-2I細胞的效率明顯高于內吞體途徑。HEK293細胞是由剪切過的5型腺病毒DNA轉染的人胚腎細胞形成的細胞系，HEK293 T細胞是能夠穩定表達SV40 T抗原的HEK293衍生細胞系。PEDV可以感染HEK293細胞，且與Vero細胞上的增殖特點相似。此外，黃病毒科成員，日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)和黃熱病毒(yellow fever virus，YFV)也可感染HEK293T細胞。由于HEK293細胞貼壁能力弱，對胰蛋白酶的耐受程度較弱，本研究在不添加胰蛋白酶的情況下，發現PDCoV可在HEK293細胞至少傳至2代，表明PDCoV可不依賴于胰蛋白酶入侵HEK293細胞。

CRISPR/Cas9系統是新發現的一種基因編輯工具，廣泛應用于研究宿主因子在病毒復制中的作用。近年來，CRISPR/Cas9系統也被應用于篩選調節病毒復制的相關宿主因子。關于APN是否為PDCoV入侵宿主細胞的受體存在爭議。本研究為驗證hAPN在PDCoV毒株CHN-SC2015復制中的作用，通過CRISPR/Cas9技術構建hAPN敲除細胞系，發現hAPN敲除導致PDCoV基因mRNA水平下調約75%，N蛋白表達水平下降約66%。本研究還通過hAPN過表達驗證其對病毒復制的影響，結果發現過表達hAPN可導致PDCoV基因mRNA水平上調2.7倍，N蛋白表達水平上調1.7倍，證實hAPN可明顯促進PDCoV復制。

冠狀病毒S蛋白主要由S1和S2結構域組成，其中S1主要負責識別受體，而S2介導宿主細胞膜與病毒囊膜的融合。有研究表明，冠狀病毒S1 RBD可以與APN結合，介導病毒入侵宿主細胞。HCoV-229E與hAPN的胞外域Ⅱ結合，而TGEV主要與pAPN的胞外域Ⅳ結合。pAPN結構域Ⅶ(581—967 aa)在PEDV復制中發揮重要作用。在PDCoV研究中，Zhu等發現PDCoV S1-CTD蛋白可結合pAPN。本研究通過序列和結構比對發現PDCoV與HCoV-229E S1 RBD具有相似的空間結構，表明PDCoV可能與hAPN結合。因此，本研究通過分子對接方法模擬PDCoV S1 RBD與hAPN的結合，發現PDCoV S1 RBD能夠通過RBM1與hAPN結構域Ⅱ結合。

4 結 論

PDCoV可以感染HEK293細胞，宿主細胞因子hAPN表達可促進PDCoV復制。此外，PDCoV S1 RBD可通過RBM1氨基酸殘基TYR、THR、THR、PHE和MET與hAPN蛋白的氨基酸殘基PHE、GLN、ARG和SER結合，證實了hAPN是影響PDCoV復制的一個重要宿主細胞因子。