抗菌肽CRAMP的安全性、穩(wěn)定性及其在清除銅綠假單胞菌生物被膜中的作用

李 會(huì)，熊 靜，梅 翠，王士源，周 洋,3，李曉芬，付貴花，張 陽(yáng), 程 鵬，何玉張，陳紅偉,3*

(1.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460; 2.西南大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院免疫學(xué)研究中心，重慶 402460; 3.國(guó)家生豬技術(shù)創(chuàng)新中心，重慶 402460)

自2008年Overhage等首次報(bào)道人源抗菌肽LL-37能抑制細(xì)菌生物被膜形成以來(lái)，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些抗菌肽具有殺滅生物被膜細(xì)菌、干擾胞外基質(zhì)(extracellular polymeric substance，EPS)產(chǎn)生和穩(wěn)定性、抑制群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)依賴性生物被膜形成等活性，將這些具有抗生物被膜活性的抗菌肽稱之為抗生物被膜肽(anti-biofilm peptides)。抗生物被膜肽因其獨(dú)特的作用機(jī)制、良好的EPS滲透性和低誘導(dǎo)耐藥等特性有望成為控制生物被膜感染的有力武器，但是潛在的細(xì)胞毒性、溶血性、穩(wěn)定性等問(wèn)題亟待解決。

CRAMP是在小鼠髓系細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)抗菌肽，其結(jié)構(gòu)和功能與LL-37極為相似，其 Gly到Leu的兩親性α螺旋區(qū)域在跨脂質(zhì)雙分子層及其抗菌活性中起著重要作用，基于這種結(jié)構(gòu)可以開(kāi)發(fā)出具有強(qiáng)抗菌活性、無(wú)溶血作用的新型抗菌肽。前期作者對(duì)13種具有潛在抗生物被膜活性的抗菌肽進(jìn)行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)僅有CRAMP對(duì)銅綠假單胞菌(，)標(biāo)準(zhǔn)株，27853成熟生物被膜有顯著清除作用，清除率達(dá)50%。后又發(fā)現(xiàn)CRAMP聯(lián)用部分抗生素抑制生物被膜的形成有明顯的協(xié)同作用，且對(duì)QS系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)有明顯的影響，抗菌肽CRAMP亦稱為抗生物被膜肽。近期，作者對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法初步探究了 CRAMP干預(yù)成熟生物被膜的作用機(jī)制。本文主要對(duì)該修飾肽的安全性、穩(wěn)定性及其對(duì)銅綠假單胞菌野生株P(guān)AO1成熟生物被膜的清除作用進(jìn)一步考察。

1 材料與方法

1.1 菌株和藥品

銅綠假單胞菌PAO1野生株購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。CRAMP和LL-37由蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司合成，CRAMP的合成和修飾詳見(jiàn)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利(201810701474.7)。恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)含量為98.9%；乳酸環(huán)丙沙星(ciprofloxacin lactate，CIP)含量為93.4%，硫酸慶大霉素(gentamicinsulfate，GM)含量為620 IU·mg，購(gòu)自上虞京新藥業(yè)有限公司；LDH Cytotoxicity Assay Kit試劑盒購(gòu)自英國(guó)Cayman Chemical公司。

1.2 主要試劑

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶均購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。MHB、TSA培養(yǎng)基等購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。1%結(jié)晶紫、Triton X-100購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(3599)、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(3516)購(gòu)自美國(guó)康寧公司。Lab-TekII腔室蓋玻片、FilmTracerLIVE/DEAD Biofilm Viability Kit購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3 溶血率檢測(cè)

參考Mohanram和Bhattachariya的試驗(yàn)方法并改進(jìn)，采集新鮮兔血制備4%的紅細(xì)胞懸液，取100 μL紅細(xì)胞懸液和100 μL CRAMP等體積混合，CRAMP終濃度為500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.812和3.906 mg·L，設(shè)置陰性對(duì)照組(PBS緩沖液)，陽(yáng)性對(duì)照組(1%Triton X-100)；37 ℃恒溫培養(yǎng)1 h，4 ℃離心(1 000 r·min5 min)，取100 μL的上清液，測(cè)OD值。溶血率的計(jì)算公式：

(AE-A陰性)/(A陽(yáng)性-A陰性)×100%

AE：CRAMP組的OD值；A陰性：陰性對(duì)照PBS緩沖液組OD值；A陽(yáng)性：陽(yáng)性對(duì)照1%Triton X-100組OD值。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，下同。

1.4 細(xì)胞毒性檢測(cè)

參考Kumar等的試驗(yàn)方法以及LDH Cytotoxicity Assay Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)，先將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，37 ℃ 5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h，加DMEM為背景對(duì)照；再在每孔加20 μL CRAMP溶液，使終濃度為500、250、125、62.5 mg·L，設(shè)置陰性對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基)、陽(yáng)性對(duì)照組(1%Triton X-100)，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，取100 μL上清液，加入至新的96孔板中，加100 μL LDH反應(yīng)液，37 ℃振蕩培養(yǎng)30 min，用酶標(biāo)儀測(cè)OD。LDH釋放率的計(jì)算公式：

LDH釋放率(%)=(OD-OD)/(OD-OD)×100

OD：CRAMP組的OD值；OD：Triton X-100陽(yáng)性對(duì)照組(最大釋放量)；OD：DMEM培養(yǎng)基陰性對(duì)照組(自然釋放量)。

1.5 熱處理對(duì)CRAMP抗菌活性的影響

參考Thery等的方法，將濃度為2 000 mg·L的CRAMP在25、50、75、100 ℃的恒溫水浴鍋中保溫30 min，未經(jīng)處理的CRAMP為對(duì)照組，分別測(cè)定不同溫度處理后CRAMP的MIC。

1.6 鹽離子對(duì)CRAMP抗菌活性的影響

參考Sun等報(bào)道的方法，配制濃度為50～250 mmol·L的NaCl和KCl溶液，分別與2 000 mg·L的CRAMP等體積混合，未經(jīng)鹽離子處理的CRAMP為對(duì)照組，測(cè)定不同鹽離子處理后CRAMP的MIC，分析鹽離子處理對(duì)CRAMP抑菌活性的影響。

1.7 蛋白酶對(duì)CRAMP抗菌活性的影響

參考Kim等報(bào)道的方法，按照3種酶(胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶)說(shuō)明書(shū)配制儲(chǔ)備液。取2 000 mg·L的CRAMP溶液分別加入3種不同的酶，使酶的反應(yīng)終濃度為1 000 mg·L，在37 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min，未經(jīng)酶處理的CRAMP為對(duì)照組，測(cè)定不同酶處理后CRAMP的MIC，分析酶處理對(duì)CRAMP抑菌活性的影響。

1.8 不同pH對(duì)CRAMP穩(wěn)定性的影響

參考Wu等報(bào)道的方法，將CRAMP溶液調(diào)pH為3、4、5、6、7、8、9和10，高壓滅菌(121 ℃ 30 min)后備用，分別配制8個(gè)pH條件下的初濃度為2 000 mg·L的CRAMP，未經(jīng)pH調(diào)整處理的CRAMP為對(duì)照組，測(cè)定不同pH調(diào)整處理后CRAMP的MIC，分析不同pH值對(duì)CRAMP抑菌活性的影響。

1.9 CRAMP對(duì)PAO1成熟生物被膜的影響

參考課題組之前報(bào)道的方法，將PAO1菌株隔夜培養(yǎng)，調(diào)整OD=0.1，并稀釋100倍，作為工作菌液。將1.2 mL工作菌液加入6孔細(xì)胞板中，37 ℃培養(yǎng)24 h，形成成熟生物被膜。棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗凈浮游菌，加入前期試驗(yàn)中篩選出的最佳作用濃度，即4倍MIC的CRAMP干預(yù)1 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，同法設(shè)置LL-37和3種抗菌藥(乳酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星、硫酸慶大霉素)為對(duì)照。

參考課題組之前報(bào)道的方法考察生物被膜量和生物被膜活菌數(shù)。用PBS緩沖液洗滌生物被膜3次。加入甲醇固定10 min。吸凈甲醇，待甲醇揮發(fā)后加入結(jié)晶紫溶液染色20 min。洗滌生物被膜后加入醋酸溶液溶解生物被膜，在630 nm處測(cè)定OD值，檢測(cè)生物被膜量(Biomass)。同法洗滌生物被膜，加入Triton，吹打混勻，充分破壞生物被膜，進(jìn)行10倍梯度稀釋。最后取100 μL涂布于TSA板上進(jìn)行生物被膜活菌計(jì)數(shù)(lg CFU·mL)。

1.10 胞外基質(zhì)(EPS)的檢測(cè)

參考陳園園和彭黨聰報(bào)道的方法進(jìn)行EPS提取與定量，將生物被膜樣品中加入PBS溶液重懸至8 mL，80 ℃ 800 r·min下，反應(yīng)1 h，高速冷凍離心機(jī)(4 ℃)離心10 min，10 000 r·min，上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾后得EPS樣品溶液。EPS組分中的多糖采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定，以葡萄糖配制標(biāo)準(zhǔn)溶液(20、25、30、35、40 mg·L)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；蛋白質(zhì)采用Folin-酚試劑法測(cè)定，以牛蛋白血清配制標(biāo)準(zhǔn)溶液(50、100、150、200、250 mg·L)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；兩者之和為EPS總量。

1.11 激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)表征生物被膜形態(tài)

參考課題組之前報(bào)道的方法，用MHB培養(yǎng)基培養(yǎng)銅綠假單胞菌過(guò)夜，調(diào)整其OD=0.1。將500 μL的菌懸液加入Lab-TekII腔室蓋玻片中。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5 d，每隔24 h更換MHB培養(yǎng)基，加入等量的新鮮MHB肉湯。培養(yǎng)5 d后，吸凈培養(yǎng)基并用0.9% NaCl溶液洗去未附著的細(xì)菌。加入500 μL的藥液干預(yù)1 h，洗滌生物被膜2次，在暗室中用FilmtracerLIVE/DEADBiofilm Viability Kit[終濃度為5 μmol·LSYTO和30 μmol·Lpropidium iodide(PI)]染色20 min。用滅菌水洗去多余的染料，在Zeiss-800共聚焦激光顯微鏡10倍物鏡和63倍物鏡下觀察生物被膜。激發(fā)波長(zhǎng)分別為488 nm(SYTO)和561 nm(PI)，發(fā)射波長(zhǎng)分別為450～560 nm(SYTO)和400～700 nm(PI)。獨(dú)立重復(fù)3次試驗(yàn)，空白組、藥物組每次均平行操作3個(gè)以上技術(shù)性重復(fù)。在10倍物鏡下隨機(jī)選取視野，并進(jìn)行Z-stack，每個(gè)組合計(jì)不少于18個(gè)視野，最后進(jìn)行熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)PAO1的最小抑菌濃度(MIC)

CRAMP及對(duì)照藥物對(duì)PAO1的MIC結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，CRAMP和LL-37對(duì)PAO1的MIC值均為15.625 mg·L，對(duì)PAO1浮游菌的抗菌效果明顯低于恩諾沙星、環(huán)丙沙星和慶大霉素。

表1 CRAMP及對(duì)照藥物對(duì)PAO1的MIC

2.2 CRAMP的溶血性

CRAMP對(duì)兔紅細(xì)胞的溶血性如圖1所示。所有受試濃度CRAMP的溶血性檢測(cè)的OD值與陰性對(duì)照組(PBS緩沖液)無(wú)差異顯著性(>0.05)，均極顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(1%Triton X-100)(<0.001)。經(jīng)計(jì)算所有受試濃度的CRAMP的溶血率均小于1.5%，即未呈現(xiàn)溶血性。

試驗(yàn)組與陰性或陽(yáng)性對(duì)照比較，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001；數(shù)據(jù)均為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，下圖同

2.3 CRAMP的細(xì)胞毒性

CRAMP作用于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7后的LDH釋放率如圖2所示。隨著CRAMP濃度的增加，RAW264.7細(xì)胞LDH釋放率呈上升趨勢(shì)。CRAMP組的LDH釋放率與陰性對(duì)照組相比，在62.5、125 mg·L濃度時(shí)無(wú)顯著性差異，但250和500 mg·L均有差異顯著性。所有測(cè)試濃度均顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組的LDH釋放率。表明當(dāng)CRAMP濃度高于250 mg·L時(shí)，隨著濃度增加，對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7的毒性逐步增大，但在62.5、125 mg·L時(shí)無(wú)細(xì)胞毒性。

圖2 CRAMP對(duì)RAW264.7細(xì)胞LDH釋放率的影響

2.4 熱處理對(duì)CRAMP抗菌活性的影響

CRAMP在25、50、75、100 ℃水浴加熱30 min后，對(duì)PAO1的MIC值如表2所示。與對(duì)照組相比較，CRAMP經(jīng)過(guò)高溫加熱后，25～75 ℃的MIC值仍為15.625 mg·L，100 ℃時(shí)MIC增大至下一個(gè)濃度梯度。說(shuō)明CRAMP具有較高的熱穩(wěn)定性。

表2 溫度對(duì)CRAMP抗菌活性的影響

2.5 鹽離子處理對(duì)CRAMP抗菌活性的影響

CRAMP經(jīng)過(guò)Na、K離子的5種濃度(50～250 mmol·L)處理后對(duì)PAO1的MIC值如表3所示。兩種離子的所有測(cè)試濃度處理CRAMP后對(duì)PAO1的MIC值均未發(fā)生變化。

表3 鹽離子對(duì)CRAMP抗菌活性的影響

2.6 不同蛋白酶處理后對(duì)CRAMP抗菌活性的影響

CRAMP經(jīng)過(guò)3種不同的蛋白酶(胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶)處理后對(duì)PAO1的MIC值如表4所示。胃蛋白酶處理后，CRAMP的MIC上升為125 mg·L(即8MIC)，但仍具有一定的抗菌活性；木瓜蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)CRAMP的抑菌活性影響最大，MIC已經(jīng)分別上升至500 mg·L和大于500 mg·L，此時(shí)的CRAMP幾乎沒(méi)有抑菌活性。

表4 蛋白酶對(duì)CRAMP抗菌活性的影響

2.7 不同pH條件下 CRAMP的抗菌活性

CRAMP經(jīng)過(guò)不同的pH的酸堿處理后對(duì)PAO1的MIC值如表5所示，在pH≥5的條件下，CRAMP的抗菌活性不受影響，在pH為3和4時(shí)，CRAMP的MIC分別為31.25 和62.5 mg·L，降低了CRAMP的抗菌活性。

表5 不同pH對(duì)CRAMP抗菌活性的影響

2.8 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中生物被膜量和生物被膜活菌測(cè)定結(jié)果

CRAMP(4MIC)組與空白對(duì)照孔比較，能有效減少生物被膜量(<0.001，生物被膜量減少率為76.74%)；LL-37(4MIC)組與空白對(duì)照孔比較，也能有效的減少生物被膜量(<0.01，生物被膜量減少率為51.16%)。3種抗菌藥物均未呈現(xiàn)顯著性變化，初步表明該濃度下的3種抗菌藥物(4MIC)對(duì)PAO1成熟生物被膜沒(méi)有抑制作用，因此后續(xù)活菌計(jì)數(shù)僅在CRAMP和LL-37中開(kāi)展。CRAMP組與空白對(duì)照孔比較，能極顯著的減少PAO1生物被膜的活菌數(shù)量(<0.001，減少了1.2個(gè)lg CFU·mL)，而LL-37組與空白對(duì)照孔比較，生物被膜活菌數(shù)未見(jiàn)顯著性變化(>0.05)。結(jié)果詳見(jiàn)圖3、4。

CRAMP.抗菌肽CRAMP；LL-37.抗菌肽LL-37；EN.恩諾沙星；CIP.乳酸環(huán)丙沙星；GM.硫酸慶大霉素；與本試驗(yàn)組的空白對(duì)照孔比較，*.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001。下同

圖4 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中各試驗(yàn)的生物被膜活菌計(jì)數(shù)

2.9 CRAMP對(duì)PAO1成熟生物被膜EPS含量的影響

將EPS樣品中的多糖和蛋白質(zhì)含量合并，并將空白對(duì)照歸一到1后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CRAMP組與空白對(duì)照孔比較，EPS含量顯著下降(<0.05)；LL-37與空白對(duì)照孔比較差異不顯著(>0.05)；兩試驗(yàn)組間比較，CRAMP組的EPS含量顯著小于LL-37組(<0.05)，表明CRAMP(4MIC)能明顯減少PAO1成熟生物被膜胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，效果優(yōu)于LL-37。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 PAO1生物被膜的胞外基質(zhì)的含量

2.10 激光共聚焦掃描顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

通過(guò)對(duì)所有Z-stack的圖像文件進(jìn)行熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CRAMP(4MIC)組與空白對(duì)照孔比較，能顯著地減少細(xì)菌總熒光強(qiáng)度(SYTO和PI熒光強(qiáng)度合計(jì)，反映死菌活菌總量)(<0.05，減少了42.41%)，LL-37(4MIC)組與空白對(duì)照孔比較，差異不顯著(>0.05)；且CRAMP(4MIC)組的細(xì)菌總熒光強(qiáng)度顯著低于LL-37(4MIC)組(<0.05)。結(jié)果表明，CRAMP對(duì)PAO1成熟生物被膜的死菌和活菌總量有顯著清除作用，且效果優(yōu)于LL-37。CRAMP(4MIC)組與空白對(duì)照孔比較，PI/SYTO(死菌熒光強(qiáng)度/活菌熒光強(qiáng)度)比值極顯著增大(<0.01)，LL-37(4MIC)組與空白對(duì)照孔比較也存在差異顯著性(<0.01)，但死菌的熒光強(qiáng)度較CRAMP組略低。進(jìn)一步表明，CRAMP對(duì)PAO1成熟生物被膜具有明顯的清除作用，對(duì)生物被膜活菌也有顯著的抑殺作用，且效果優(yōu)于LL-37，結(jié)果詳見(jiàn)表7。代表性的CLSM圖見(jiàn)圖5。

表7 CLSM的熒光強(qiáng)度分析

A.Control組的正交圖；B.Control組3D圖；C.CRAMP組的正交圖；D.CRAMP組3D圖；E.LL-37的正交圖；F.LL-37組3D圖

3 討 論

我國(guó)從2020年開(kāi)始在飼料中全面禁止添加抗生素，開(kāi)發(fā)替代傳統(tǒng)抗生素的安全、高效的新型抗菌劑已是全球性共識(shí)。抗菌肽被廣泛譽(yù)為抗生素替代品，但是當(dāng)前限制抗菌肽臨床應(yīng)用的主要因素包括溶血性、細(xì)胞毒性以及不穩(wěn)定性，在已發(fā)現(xiàn)的眾多抗菌肽中，盡管有些具有較強(qiáng)的抑菌活性，但往往也具有較高的溶血性和較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，通常情況下5%以下的家兔紅細(xì)胞溶血率即可認(rèn)為是無(wú)溶血性，本試驗(yàn)中所有測(cè)試濃度的CRAMP對(duì)兔紅細(xì)胞的溶血率均未超過(guò)1.5%，表明所測(cè)試濃度的CRAMP對(duì)家兔紅細(xì)胞未呈現(xiàn)溶血性，與文獻(xiàn)報(bào)道具有一致性，如Gallo等報(bào)道CRAMP在濃度為50 μmol·L(約194 mg·L)時(shí)對(duì)人和羊紅細(xì)胞無(wú)溶血活性，CRAMP-18的類(lèi)似物具有抗菌活性但沒(méi)有溶血性。CRAMP的低溶血性可能是因?yàn)榫哂凶罡呤杷运降闹咀搴头枷阕灏被岙惲涟彼?Ile)和苯丙氨酸(Phe)有關(guān)。另外，脯氨酸(Pro)和賴氨酸(Lys)的存在也能降低其溶血性。另外，本試驗(yàn)中CRAMP濃度低于125 mg·L時(shí)對(duì)RAW264.7 細(xì)胞無(wú)毒性，此濃度遠(yuǎn)高于最小抑菌濃度，當(dāng)CRAMP在250 mg·L時(shí)出現(xiàn)了一定的細(xì)胞毒性。與文獻(xiàn)報(bào)道也具有一致性，如李楊報(bào)道20 mg·kg劑量的CRAMP經(jīng)腹腔注射小鼠并不會(huì)對(duì)小鼠造成明顯的毒性反應(yīng)和器官損傷。Winderickx等報(bào)道了CRAMP的衍生物對(duì)HepG2細(xì)胞沒(méi)有毒性。Nagaram等報(bào)道了抗菌肽MF18對(duì)RAW 264.7的細(xì)胞毒性以及人紅細(xì)胞的溶血性，表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性和溶血性，并分析該肽富含帶正電荷的賴氨酸對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜具有很強(qiáng)的親和力，因此降低了對(duì)真核細(xì)胞的毒性，CRAMP也富含大量的賴氨酸，因此推測(cè)其低細(xì)胞毒性與此相關(guān)。

高鹽、高熱等外界因素以及復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境通常會(huì)影響抗菌肽的穩(wěn)定性。作者發(fā)現(xiàn)，高鹽、高熱和高pH條件對(duì)CRAMP的抗菌活性均未產(chǎn)生明顯影響，但是低pH(<4)，尤其是3種蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶)能明顯降低CRAMP的抗菌活性。魏曉曉等報(bào)道了75～100 ℃的高溫、80～100 mmol·L的高濃度NaCl和pH4.0及pH10.0的高酸堿性對(duì)人工合成抗菌肽JH-3的抑菌活性沒(méi)有明顯的影響。Starr和Wimley發(fā)現(xiàn)多種抗菌肽能被人紅細(xì)胞蛋白酶降解，通常認(rèn)為抗菌肽具有蛋白酶的酶切位點(diǎn)就容易被酶解失活。而將抗菌肽進(jìn)行環(huán)化處理，可以形成限制性構(gòu)象而增強(qiáng)與靶分子的結(jié)合性能和對(duì)受體的選擇性，具有低毒、易于穿透細(xì)胞膜、抵抗外肽酶和內(nèi)肽酶的水解等特點(diǎn)，較線性肽具有更多生物學(xué)活性和醫(yī)藥價(jià)值。

總之，天然抗菌肽存在抗菌活性不高、會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性和溶血性等缺陷，一定程度上阻礙了抗菌肽的臨床應(yīng)用，可采用改變其多肽鏈電荷量或疏水性的方式對(duì)天然抗菌肽進(jìn)行分子改造，以獲得具有良好抑菌活性、且細(xì)胞毒性較小的抗菌肽類(lèi)似物。本文采用的CRAMP(34個(gè)氨基酸)是在天然CRAMP(38個(gè)氨基酸)基礎(chǔ)上修飾改造而得，提高了其安全性和穩(wěn)定性，但是蛋白酶穩(wěn)定性還有待改善，本課題組近期也成功設(shè)計(jì)合成了環(huán)狀多肽Cyclic-CRAMP，另外采用納米修飾等來(lái)提高CRAMP的蛋白酶穩(wěn)定性，但其生物學(xué)活性還有待深入考察。

也稱綠膿桿菌，是一種常見(jiàn)的人畜共患條件性致病菌。近年來(lái)，隨著全國(guó)各地養(yǎng)殖規(guī)模、飼養(yǎng)方式、畜禽貿(mào)易以及防制措施等方面的變化，銅綠假單胞菌病發(fā)病率顯著上升，往往造成幼小畜禽的銅綠假單胞菌病大群暴發(fā)。2017年，世界衛(wèi)生組織將列為最嚴(yán)重威脅的12種細(xì)菌之一，并列為急需開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物的病原體。總之，該菌對(duì)大部分常見(jiàn)抗生素耐藥，感染易反復(fù)發(fā)作, 難以清除，究其原因主要是極易形成生物被膜，因此也常作為生物被膜研究的模式菌株。當(dāng)前，已有大量圍繞干預(yù)生物被膜的研究報(bào)道，為防控生物被膜感染奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，但是這些研究主要集中在抑制生物被膜的形成階段。而隨著生物被膜不斷堆積，發(fā)育成具有典型蘑菇樣結(jié)構(gòu)的成熟生物被膜時(shí)，傳統(tǒng)的抗生素很難滲透進(jìn)入已經(jīng)高度結(jié)構(gòu)化的成熟生物被膜殺死生物被膜內(nèi)細(xì)菌，即使能進(jìn)入一部分，但對(duì)生物被膜內(nèi)低生長(zhǎng)率和低代謝活性的細(xì)菌，尤其是持留菌更是束手無(wú)策。但實(shí)際上在臨床中，常常面臨的是已經(jīng)形成的生物被膜，即成熟生物被膜。因此，加速對(duì)成熟生物被膜清除的研究已經(jīng)成為迫切需要解決的問(wèn)題。前期，作者通過(guò) 96 孔細(xì)胞板篩選發(fā)現(xiàn) CRAMP對(duì)于PAO1 成熟生物被膜呈濃度依賴性抑制，在4MIC濃度，即62.5 mg·L時(shí)達(dá)到最高(抑制率 56.56%)，本試驗(yàn)以1.2 mL的培養(yǎng)體系在6孔細(xì)胞板中建立24 h成熟生物被膜，并設(shè)置了4倍MIC的LL-37和3種抗菌藥(乳酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星、硫酸慶大霉素)為對(duì)照，結(jié)果顯示，CRAMP能顯著減少生物被膜量，減少率達(dá)76.74%，同時(shí)極顯著地減少了PAO1生物被膜的活菌數(shù)量，減少了1.2個(gè)lg CFU·mL，即90%以上的生物被膜細(xì)菌被抑殺，表明CRAMP對(duì)PAO1成熟生物被膜具有明顯的清除作用，效果優(yōu)于LL-37和3種抗菌藥。另外，CRAMP也能明顯減少PAO1成熟生物被膜胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，效果也優(yōu)于LL-37。

另外，本試驗(yàn)在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)激光共聚焦顯微鏡觀察PAO1生物被膜時(shí)的染色條件進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行了3D結(jié)構(gòu)重構(gòu)，更加直觀地反映出了生物被膜的厚度和整體密度。對(duì)多次獨(dú)立重復(fù)的不同視野進(jìn)行Z-stack掃描，并將掃描文件的熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，CRAMP干預(yù)生物被膜后除了總熒光強(qiáng)度顯著降低外，死菌的比例也顯著升高了，進(jìn)一步驗(yàn)證了CRAMP對(duì)PAO1成熟生物被膜具有明顯的清除作用，對(duì)生物被膜活菌有顯著的抑殺作用，且效果優(yōu)于LL-37。與前面的生物被膜量和生物被膜活菌數(shù)的研究結(jié)果相吻合。

綜上表明，CRAMP對(duì)臨床控制生物被膜感染具有一定的指導(dǎo)意義，同時(shí)也為后續(xù)開(kāi)展其作用機(jī)制研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

CRAMP具有低溶血性、低細(xì)胞毒性，除蛋白酶作用不穩(wěn)定外，具有較好的穩(wěn)定性，對(duì)PAO1成熟生物被膜具有明顯的清除作用，且效果優(yōu)于LL-37和常見(jiàn)的抗菌藥。