共軛亞油酸影響邊雞胸肌脂類代謝的相關差異基因的篩選

張俊珍，張 蒙，李亞莉，常強強，孫天原

(1.山西農業大學動物科學學院，太谷 030801；2.山西省養殖技術試驗基地，太原 030000)

共軛亞油酸(conjugated linoleic acids，CLA)是一類含有共軛雙鍵的亞油酸異構體，主要以c9,t11-CLA和t10,c12-CLA這兩種異構體為主。CLA是食物中的天然成分，主要發現于反芻動物脂肪和牛奶產品中。除天然來源以外，CLA還可以通過對亞油酸熱異構化處理和部分氫化獲得。CLA具有廣泛的生物學功能：調節脂類代謝，降低脂肪沉積、抗動脈粥樣硬化、抗癌、抗氧化、提高免疫性能和改善骨骼健康等。

邊雞主要分布在內蒙古自治區與山西省北部相毗連的長城內外一帶，具有蛋重大、肉質好、適應性強、耐粗飼和抗寒等優點，是肉蛋兼用的中國地方品種。因其肉質鮮美，肉色紅潤而深受當地老百姓歡迎。隨著肉雞體重增加，過量的腹部脂肪沉積會使胴體品質下降。肉雞胴體脂肪過多，生產中會給肉雞加工企業帶來較大的經濟損失。降低雞肉脂肪含量，生產優質雞肉，既符合人們的健康需求，又促進了家禽產業的發展。據報道，在飼料中添加CLA可以抑制成脂分化進程和脂肪合成，下調與成脂分化和脂質合成相關基因的表達水平，從而降低體脂沉積，增加胴體瘦肉率，提高肉產品中CLA的含量，并改善肉品質。Lavandera等研究表明，在小鼠飼料中添加1% CLA能夠降低、、和-1c的基因表達水平，抑制脂肪沉積。Yeganeh等在小鼠脂肪細胞中研究發現，CLA可以通過影響3T3-L1脂肪細胞中的Wnt/β-catenin通路來抑制脂肪細胞分化，從而抑制脂肪生成。Wang等在豬飼糧中添加1.5% CLA并采集脂肪組織進行高通量測序，結果發現CLA可以通過調節Wnt信號通路來抑制脂肪組織中脂肪生成，調節體脂沉積。張天穎用0、100、200 μmol·Lt10,c12-CLA處理山羊乳腺上皮細胞并進行轉錄組測序，共得到25 153條轉錄本，并通過對差異表達基因進行GO和KEGG富集分析，發現t10,c12-CLA可以抑制山羊乳腺上皮細胞脂肪酸合成以及固醇合成相關基因的表達，信號通路顯著富在PPAR和AMPK通路中，從而調控脂代謝。駱娜對黃羽肉雞的胸肌組織和腹脂組織進行轉錄組測序，結果發現，、、1和1等基因參與調控胸肌肌內脂肪沉積；1、和等基因參與調控腹脂沉積。歐小倩采集黃山黑雞大腿肌肉組織進行轉錄組測序，共篩選出128個差異表達基因，其中94個基因上調，34個基因下調，對這些差異表達基因進行GO和KEGG分析，篩選出0S2、4、等14個影響肌內脂肪含量的候選基因，發現12個GO條目和4個KEGG通路顯著富集在脂肪代謝相關信號通路中。目前，人們在研究CLA影響動物機體脂肪沉積途徑的分子機制中，對豬、羊、小鼠等的報道很多，但是對家禽相關的報道幾乎沒有。

本試驗以邊雞為研究對象，在基礎日糧中添加不同比例的CLA進行飼養試驗，通過轉錄組測序技術篩選出與邊雞胸肌脂類代謝相關的主要調控基因，對差異表達基因進行GO功能和KEGG通路富集分析，為揭示CLA影響邊雞胸肌脂類代謝的分子作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

試驗動物在山西省養殖技術試驗基地進行飼養，選取90日齡健康邊雞180只，隨機分成5組，每組3個重復，分別添加不同比例的CLA 0%(對照組)、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%。對照組添加豆油，試驗組分別在基礎日糧中以等量的CLA替換豆油，添加豆油以確保各組飼料中能量相同，CLA購自青島澳海生物有限公司(CLA含量為80%)。試驗預飼期1周，正飼期6周。基礎日糧參照《雞飼養標準》(NY/T 33-2004)配制，基礎日糧組成及營養成分見表1。飼養試驗結束后，每組隨機選取6只邊雞進行屠宰取樣，頸靜脈放血法處死，采集胸肌組織，立刻投入液氮速凍，后轉入-80 ℃保存。

表1 基礎日糧組成及營養成分

1.2 組織總RNA提取及轉錄組測序

稱取邊雞胸肌組織50～100 mg，采用Trizol法提取組織總RNA。用Agilent 2100生物分析儀進行總RNA品質檢測。用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；加入破碎緩沖液將mRNA隨機打斷；以mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈；純化cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，進行片段大小選擇；最后通過PCR富集得到cDNA文庫。庫檢合格后，用Illumina平臺進行測序，由北京百邁客生物科技有限公司完成文庫構建及測序。

1.3 轉錄組生物信息學分析

將原始數據(Raw Data)去除含有接頭的Reads和低質量的Reads(含N比例>10%的Reads和質量值Q≤10的堿基數占整條Read的50%以上的Reads)得到高質量的Clean Data。使用HISAT2軟件將Clean Data與指定的參考基因組進行序列比對。基于所選參考基因組序列，使用StringTie軟件與原有的基因組注釋進行比較，挖掘新基因；根據基因在不同樣品中的表達量進行差異表達分析。

1.4 差異表達基因(DEGs)分析

StringTie通過最大流量算法,采用FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)作為衡量基因表達水平的指標，FPKM是將Map到基因的Fragments數除以Map到Genome的所有Read數(以Million為單位)與RNA的長度(以KB為單位)。使用DESeq2軟件進行差異表達分析。在DEGs檢測過程中，將Fold Change≥1.5且value<0.05作為篩選標準。差異倍數(Fold Change)表示兩樣品間表達量的比值。

1.5 GO和KEGG功能注釋和富集分析

利用GO(Gene Ontology database)數據庫和KEGG(The database of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數據庫對DEGs進行GO功能分類和信號通路富集分析。

1.6 實時熒光定量PCR(qPCR)驗證

為保證轉錄組測序結果的準確性，隨機選取9個DEGs進行qPCR驗證。選擇-作為內參基因，用Oligo 7軟件設計引物，交由華大基因合成，引物序列見表2。選擇TB GreenPremix Ex TaqⅡ試劑盒(Code：RR820A)進行qPCR驗證，反應總體系10 μL：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 5.0 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 1.0 μL，ddHO 3.6 μL。反應條件：95 ℃，30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，45個循環；65 ℃ 5 s，95 ℃ 30 s。使用2法計算目的基因的相對表達量。

表2 實時熒光定量PCR引物

2 結 果

2.1 測序數據及其質量控制

通過百邁客云平臺BMK Cloud對添加不同比例CLA的邊雞胸肌樣本進行轉錄組測序，共得到68.97 Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達到5.36 Gb。GC堿基含量在52.36%～56.56%之間；Q20堿基百分比≥96.84%；Q30堿基百分比≥92.30%(表3)。上述結果表明，轉錄組測序數據質量高，可用于后續試驗進一步分析。

表3 測序數據統計表

2.2 測序數據與參考基因組比對結果

采用HISAT2軟件將過濾后各樣品的Clean Reads與指定的參考基因組進行序列比對。結果顯示，各樣品轉錄組測序的總片段數分別在35～72百萬對之間。各樣品的Reads與參考基因組的比對效率在77.72%～85.81%之間；比對到參考基因組唯一位置的Reads數目及在Clean Reads中占的比例在72.15%～82.61%；比對到參考基因組多處位置的Reads數目及在Clean Reads中占的比例在2.85%～6.58%之間；比對到參考基因組正鏈的Reads數目比例在38.78%～42.82%；比對到參考基因組負鏈的Reads數目比例在38.89%～42.95%。上述結果表明測序數據符合試驗要求，可以進行后續分析(表4)。

表4 轉錄組測序數據與參考基因組比對結果統計表

2.3 差異表達基因相關性分析及數目統計

用所選參考基因組序列與原有的基因組注釋信息進行比較，共發掘3 550個新基因。使用DIAMOND軟件將發掘的新基因與GO、KEGG等數據庫進行序列比對，共有783個新基因得到功能注釋。皮爾遜相關系數r(Pearson’s Correlation Coefficient)是生物學重復相關性的評估指標，r越接近1，說明兩個重復樣品相關性越強(圖1)。從圖1中看出，不同試驗組中的2個重復樣品的r均大于0.9，說明樣品重復性較好，試驗可靠性高。

圖1 不同樣品間的皮爾遜相關分析

使用DESeq2軟件對轉錄組測序數據進行差異表達分析，將Fold Change≥1.5且value<0.05作為篩選標準。結果共篩選出DEGs 1 229個，其中上調基因594個，下調基因635個(表5)。

表5 差異表達基因數目統計表

通過火山圖(volcano plot)可以快速地查看基因在兩組樣品中表達水平的差異，以及差異的統計學顯著性(圖2)。火山圖橫坐標絕對值越大，說明表達量在兩樣品間的表達量倍數差異越大；縱坐標值越大，表明差異表達越顯著，篩選得到的DEGs越可靠。

A.0 vs.0-5；B.0 vs.1；C.0 vs.1-5；D.0 vs.2(下同)。圖中每一個點表示一個基因，綠點代表下調差異表達基因，紅點代表上調差異表達基因，黑點代表非差異表達基因

2.4 差異表達基因的GO功能富集分析

運用GO數據庫進行功能富集分析。結果顯示(圖3)，共有1 045個DEGs被GO數據庫注釋。DEGs在生物學過程中主要參與細胞過程(cellular process)、單一生物過程(single-organism process)、生物調節(biological regulation)和代謝過程(metabolic process)等功能；在分子功能中主要參與結合(binding)和催化活性(catalytic activity)等功能；在細胞組分中主要參與細胞(cell)、細胞部分(cell part)、細胞器官(organelle)和膜(membrane)等功能。

橫坐標為GO功能分類;縱坐標左邊為基因數目所占百分比,右邊為基因數目

2.5 差異表達基因的KEGG通路富集分析

運用KEGG數據庫進行差異表達基因的通路富集分析。結果顯示，共有989個DEGs被KEGG注釋。這些DEGs共富集到389條信號通路，選取每組顯著性q value值最小的前20個通路作散點圖(圖4)。從圖中可以看出，添加0.5% CLA時，DEGs顯著富集在ECM-受體相互作用(ECM-receptor interaction)和黏著斑(focal adhesion)等通路中；添加1% CLA時，DEGs顯著富集在吞噬體(phagosome)、細胞凋亡(apoptosis)和ECM-受體相互作用(ECM-receptor interaction)等通路中；添加1.5% CLA時，DEGs顯著富集在吞噬體(phagosome)、肌動蛋白細胞骨架調節(regulation of actin cytoskeleton)和細胞因子-細胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)等通路中；添加2% CLA時，DEGs在信號通路中不顯著富集。

縱坐標表示通路名稱，橫坐標為富集因子。圓圈顏色代表q value值，圓圈的大小表示通路中富集的基因數目

2.6 脂類代謝相關差異表達基因的篩選

通過GO和KEGG功能注釋分析，共篩選出18個與邊雞胸肌脂類代謝相關的DEGs(表6)。從表6可以看出，在基礎日糧中添加1.5% CLA時有8個基因的表達量與對照組的表達量相比顯著上調(<0.05)，添加0.5%、1%和2%的CLA時基因表達量與對照組相比差異不顯著。添加0.5% CLA時有5個基因的表達量與對照組相比顯著上調(<0.05)，添加1%、1.5%和2%的CLA時基因表達量與對照組相比差異不顯著。有3個基因添加2%的CLA時表達量與對照組相比顯著下調(<0.05)，添加0.5%、1%和1.5%的CLA時差異不顯著。有2個基因添加1.5%的CLA時表達量與對照組相比顯著下調(<0.05)，添加0.5%、1%和2%的CLA時差異不顯著。

表6 邊雞胸肌中與脂類代謝相關的差異表達基因

2.7 qPCR驗證差異表達基因

為進一步驗證轉錄組測序結果的準確性，隨機選取9個DEGs進行qPCR驗證(圖5)。結果表明，這9個基因的mRNA表達量變化趨勢與轉錄組測序結果一致，說明本試驗轉錄組測序結果準確性好。

橫坐標表示5個試驗組

3 討 論

轉錄組測序是利用高通量測序技術將細胞或組織中全部或部分mRNA和非編碼RNA進行測序分析的技術。CLA具有調節脂類代謝的功能，通過調控參與脂類代謝的相關基因，降低脂肪沉積。本研究通過轉錄組測序，共鑒定出3 550個新基因，其中783個新基因得到功能注釋。各試驗組中的2個重復樣品間的皮爾遜相關系數大于0.9，表明試驗結果可靠。使用DESeq2軟件對測序數據進行差異性分析，共篩選出DEGs 1 229個，其中上調基因594個，下調基因635個。隨機選取9個DEGs進行qPCR驗證，其基因表達量變化趨勢與轉錄組測序結果一致，表明轉錄組測序結果可靠。

通過對DEGs的篩選，共篩選出18個主要參與邊雞胸肌脂類代謝的DEGs。試驗組基礎日糧中添加CLA有13個DEGs表達量上調，、2、、、、1、3A2、、3、1、3、1和24已被發現參與調控脂肪代謝。1.5% CLA試驗組中有5個基因(、1、、3A2和)的表達量差異極顯著。MCAT是脂肪酸合成酶(FAS)Ⅱ脂肪酸代謝途徑中FAS復合體組成酶之一，在脂肪酸合成途徑中起裝載作用。有研究表明，參與了脂肪酸代謝過程，被認為是脂肪酸代謝途徑的結合點。1是高密度脂蛋白(HDL)的主要載脂蛋白，占蛋白總量的60%～70%。載脂蛋白是一種具有脂類轉運功能的血漿蛋白質，在脂質代謝和脂質運輸等過程中發揮重要的做作用。PTGDS是一種谷胱甘肽非依賴性的前列腺素合成酶，能夠催化前列腺素H2(PGH2)轉化為前列腺素D2(PGD2)，前列腺素是脂肪酸代謝的終末產物，參與機體正常生理過程。ALDH3A2是醛脫氫酶家族成員之一，催化長鏈脂肪醛氧化為脂肪酸，調控脂質代謝。PLTP介導脂蛋白之間的磷脂轉運，參加脂質和脂蛋白代謝。0.5% CLA試驗組中有3個基因(3、1和3)的表達量差異極顯著。FABP3屬于脂肪酸結合蛋白家族，主要調節脂肪酸的吸收和代謝。FOXO1是叉頭蛋白框O亞族(FOXO)成員之一，可以降低脂肪酸氧化，調控脂質代謝。UCP3是解偶聯蛋白(UCPs)家族成員之一，能夠調節脂肪酸代謝，運輸脂肪酸和脂質過氧化物。Ribot等研究發現，飼料中添加1% CLA使3 mRNA表達水平升高，調節脂肪酸代謝，降低脂肪沉積。本試驗結果表明，基礎日糧中添加CLA使一些主要調控脂類代謝的基因表達量上調，5個基因在1.5% CLA試驗組表達量極顯著上調，已發現這5個基因主要參與脂肪酸合成，在脂肪酸的合成和代謝途徑中起裝載和結合點作用，參與脂質運輸、催化前列腺素合成、催化長鏈脂肪醛氧化為脂肪酸以及調節脂蛋白代謝；3個基因在0.5% CLA試驗組表達量上調且差異極顯著，已發現這3個基因主要參與脂肪酸的吸收、氧化和運輸。本試驗結果發現，基礎日糧中添加1.5%和0.5% CLA可能會對胸肌脂類代謝調控起主要作用，具體調控機理有待進一步研究。從DEGs的調控功能發現，1.5% CLA可能調控邊雞胸肌脂肪酸的富集。試驗組基礎日糧中添加CLA有5個DEGs表達量下調，4、4、、2C和5已被發現參與調控脂肪代謝。2% CLA試驗組中4的基因表達量差異極顯著，4屬于脂肪酸結合蛋白家族，主要在脂肪細胞中表達，負責脂肪酸的合成和運輸。O’Reilly等研究發現，給小鼠飼喂含CLA的飼料能夠降低4表達水平，從而降低脂肪沉積，減少肥胖發生。本試驗結果發現，在基礎日糧中添加2%的CLA可極顯著降低4基因表達，從而影響胸肌脂肪酸代謝，具體調控機理有待進一步研究。本研究對DEGs的篩選發現各個試驗組中出現不同的差異顯著的DEGs，揭示了基礎日糧中添加CLA影響邊雞胸肌DEGs表達水平，進而調控脂肪代謝，為今后相關研究提供理論依據。

對DEGs的GO功能富集分析，發現各試驗組邊雞胸肌組織中DEGs主要集中在生物學過程的細胞過程、單一生物過程、生物調節和代謝過程，其次集中在分子功能和細胞組分。GO功能富集分析發現，DEGs可能主要在生物學過程中參與調控脂類代謝，其調控機制有待研究。對各試驗組差異表達基因的KEGG通路富集分析發現，各試驗組DEGs所富集的信號通路不同，表明基礎日糧中CLA含量影響ECM-受體相互作用、黏著斑、吞噬體、細胞凋亡、肌動蛋白細胞骨架調節和細胞因子-細胞因子受體相互作用等通路功能的實現，可能參與脂類代謝調控，其作用機制有待研究。

4 結 論

本試驗探究了在邊雞基礎日糧中添加CLA對胸肌脂類代謝影響的研究，利用轉錄組測序技術篩選出18個與邊雞胸肌脂類代謝相關的差異表達基因，其中、1、、3A2、、3、1、3和4可能在調節邊雞胸肌脂肪代謝過程中發揮了重要作用，為今后揭示CLA調節邊雞胸肌脂類代謝的分子作用機制提供了理論依據。